[发明专利]检测传染性肌肉坏死病毒的遗传标志物及使用该遗传标志物检测传染性肌肉坏死病毒的方法

说明书

本发明涉及用于检测传染性肌肉坏死病毒的遗传标志物，以及使用所述遗传标志物检测传染性肌肉坏死病毒的方法，并且更具体地涉及包括以下的方法：扩增传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的特定核酸；杂交特异性识别扩增产物的肽核酸(PNA)；控制杂交产物的温度以获得温度依赖性解链曲线；以及通过分析解链曲线确定解链温度来检测传染性肌肉坏死病毒或确定虾是否感染了所述病毒。根据本发明，可以简单、快速和准确的方式检测传染性肌肉坏死病毒(IMNV)，因此可早日阻止被认为是对虾养殖威胁最大的病毒的感染和传播。

技术领域

本发明涉及用于检测传染性肌肉坏死病毒(infectious myonecrosis virus)的遗传标志物(genetic marker)，以及使用所述遗传标志物检测传染性肌肉坏死病毒的方法，并且更具体地涉及包括以下的方法：扩增传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的特定核酸；杂交特异性识别扩增产物的肽核酸(PNA)；控制杂交产物的温度以获得温度依赖性解链曲线(melting curve)；以及通过分析所获得的解链曲线确定解链温度(melting temperature)来检测传染性肌肉坏死病毒或确定虾是否感染了所述病毒。

背景技术

虾占全球水产品贸易量的17％，并且75％的虾由水产养殖生产(FAO,2009)。虽然全球的虾养殖业大幅增长，但由于疾病暴发造成的虾损失也在持续增加。实际上，自从1994年以来，预计由病毒疾病造成的虾损失是每年约30亿美元($US)以上。

传染性肌肉坏死(IMN)，近年来报道的新型疾病，2002年在巴西东南部地区的白腿虾(Litopenaeus vannamei)水产养殖场首次报道，并且2004年传播至巴西的其他地区，并且2006年在印度尼西亚的爪哇岛也有报道，其中养殖了从巴西进口的虾苗。此后，传染性肌肉坏死(IMN)被传播至整个东南亚地区(包括泰国)、中国等，并且已经被认为特别是白腿虾的最大威胁。

传染性肌肉坏死(IMN)，是一种在韩国没有报道的传染性疾病，被归为二类传染性水生生物疾病，并且已经被分为需要预防措施的国家通报的传染性疾病。然而，近年来，在韩国的白腿虾苗养殖场中也有检测出传染性肌肉坏死(IMN)的情况。因此，需要加强监控以阻止传染性肌肉坏死(IMN)在韩国的流入和传播。

导致肌肉坏死的病毒是传染性肌肉坏死病毒(IMNV)。传染性肌肉坏死病毒(IMNV)是一种全病毒(totivirus)，并且已知与属于整体病毒科(the familyTotiviridae)的蓝氏贾第虫鞭毛病毒(Giardia lablia virus)密切相关。传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的基因由7560bp的单链、双链RNA分子组成。已知传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的感染导致大范围的疾病，并且增加水产养殖业的死亡率。已知传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的主要宿主物种为南美白对虾(Penaeus vannamei)。

进入传染性肌肉坏死病毒(IMNV)的急性传染阶段的虾显示白色坏死部分集中在横纹肌(骨骼肌)或覆盖广泛的区域。具体地，可能有一些由于坏死造成腹部结和尾扇变红的虾。受疾病严重影响的虾处于垂死状态，并且在虾经受“应激(stress)”后，虾的死亡率可能立即迅速增加，并且这种增加可能持续数日。

近年来，为了诊断传染性肌肉坏死病毒(IMNV)，已经开发了基于分子诊断的诊断方法和试剂盒。在所述方法中，主要使用的方法包括：进行一般聚合酶链式反应(PCR)；和通过电泳分析反应的扩增产物，或使用荧光探针或SYBR绿通过实时PCR分析扩增产物。

具体地，为了诊断传染性肌肉坏死病毒(IMNV)，根据世界动物卫生组织(OIE)水生动物卫生法典中提出的标准，进行常规PCR以获得扩增产物，并且通过电泳分析扩增产物，之后克隆扩增产物，并且纯化的质粒DNA的核苷酸序列通过诸如桑格测序(Sangersequencing)的方法来分析。因此，缺点在于程序复杂，并且疾病诊断的分析耗时。