[发明专利]一种TGFBI基因多态性快速检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种TGFBI基因多态性快速检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

TGFBI基因编码转化生长因子β诱导分泌蛋白，该基因编码含RGD序列的蛋白与胶原蛋白I、II和IV结合，且RGD motif既调节细胞吸附也可以作为不同整合素识别配体序列。此外，该蛋白在调控细胞内胶原蛋白相互作用和诱导软骨成骨形成过程中扮演重要角色；同时该蛋白能抑制细胞吸附。

TGFBI基因的突变引起多种眼角膜营养障碍，存在R124H、R555W、R555Q、R124C、R124L、P501T位点中任何一种变异均会使患者在近视矫正手术后引发失明风险，因此，开展TGFBI基因上述位点检测具有重要意义。

TGFBI基因的检测首先需要将其从核酸中释放出来，而单核苷酸多态性检测方法有多种，常见的有普通PCR之后，采用电泳进行分析；有采用基因芯片法进行单核苷酸多态性基因检测；有采用第二代测序技术进行基因单核苷酸多态性分析；各自有其独特的特点。传统方法技术操作复杂繁琐，准确性不高，基因芯片通量高，但也有比较大误判率，第二代测序技术准确性高，但周期长，成本昂贵；并且上述方法均需要提供高纯度的高浓度的核酸作为检测模板。因此，亟待开发出一种快速完成核酸释放，并且不影响下游检测的核酸释放剂，同时开发出一套特异性高的单核苷酸多态性检测的试剂盒。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种TGFBI基因多态性快速检测试剂盒及其检测方法，目的是采用核酸快速释放剂方法完成样本核酸释放，在普通PCR的基础上，在PCR体系中加入特异性地荧光基团探针或染料，达到实时监控PCR扩增反应，扩增TGFBI基因的核酸片段，再以TaqMan探针法进行单核苷酸多态性分析。

本发明的TGFBI基因多态性快速检测试剂盒由核酸释放剂、探针混合物、2X反应缓冲液、阳性质控品、阴性质控品和超纯水组成；

所述的核酸释放剂由5～500mM Tris-HCl,、50～1000mM NaCl，0.1～10mM EDTA、质量/体积比为0.01％～2％的十二烷基磺酸钠(SDS)、质量/体积比为0.04％～3％的十二烷基硫酸锂(LLS)和质量/体积比为0.01％～2％的甜菜碱组成，其中的百分比以无菌水体积为计算基准；

所述的探针混合物是TGFBI基因的R124H、R555W、R555Q、R124C、R124L或P501T位点引物探针，探针3’端的淬灭基团可以为：BHQ1、BHQ2、MGB、TAMRA、Eclipse-2或Dabcy1-2，具体如下：

探针混合物#1：TGFBI基因R124H位点引物探针：

上游引物：5'-CATCCCTCCTTCTGTCTTCTG-3'

下游引物：5'-CGGAGGTCATCTCACAGC-3'

FAM-5'-CACTCAGCTGTACACGGACCGCACGG-3'-Q

VIC-5'-TCTCAGGCCTCAGCTTCTCCGTGTG-3'-Q；

探针混合物#2：TGFBI基因R555W位点引物探针：

上游引物：5'-GGTAGCTGCCATCCAGTC-3'

下游引物：5'-GTCTTGTCATAAAATCCCTTCAA-3'

FAM-5'-AGCCCTGCCACCAAGAGAACGGAGC-3-Q'

VIC-5'-GTCTTTACCCAAGAGTCTGCTCCATTCTCTTG-3-Q'；

探针混合物#3：TGFBI基因R555Q位点引物探针：

上游引物：5'-GGTAGCTGCCATCCAGTC-3'

下游引物：5'-GTCTTGTCATAAAATCCCTTCAA-3'

FAM-5'-AGCCCTGCCACCAAGAGAACGGAGC-3'-Q

VIC-5'-GTCTTAGCCCAAGAGTCTGCTCCATTCTCTTG-3'-Q；

探针混合物#4：TGFBI基因R124C位点引物探针：

上游引物：5'-CATCCCTCCTTCTGTCTTCTG-3'

下游引物：5'-CGGAGGTCATCTCACAGC-3'

FAM-5'-CACTCAGCTGTACACGGACCGCACGG-3'-Q

VIC-5'-TCTCAGGCACCAGCTTCTCCGTGTG-3'-Q；