[发明专利]循环肿瘤细胞多种标志物联合检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种循环肿瘤细胞表面多种干细胞标志物联合检测试剂盒及其应用。

背景技术

近年来肝细胞肝癌的发病率和死亡率迅速上升，跃居恶性肿瘤第五位。虽然治疗技术有了很大的提高，但5年生存率没有明显改善，约50％的患者在术后5年发生肿瘤复发或远处转移。因此，预测肝癌患者术后复发以便早期进行必要的干预是进一步改善肝癌预后的关键。临床迫切需要一种有效、可靠的检测技术解决疾病早期诊断、高风险复发的筛查、抗肿瘤治疗的效果评价、预防并控制远处转移等HCC治疗中所面临的难题。

循环肿瘤细胞(CTC)是指有原发肿瘤或肿瘤转移灶释放入外周血的肿瘤细胞，在健康人体内极为罕见。根据文献报道，循环肿瘤细胞在恶性肿瘤形成早期即可释放入血。循环肿瘤细胞由原发灶释放进入血液循环，是恶性肿瘤复发和转移的关键步骤。因此，CTC检测被认为是一种新的诊断技术，一项新的预后评价工具、一项有效的恶性肿瘤治疗应答的预测指标，在临床应用中被寄予极高期望。CTC的检测有助于早期肿瘤患者的诊断、术后患者监测肿瘤的复发与转移、评估抗肿瘤药物的敏感性与患者预后以及选择个体化的治疗策略。

一般而言，CTC检测的方法大致可以分为细胞计数技术和基于核酸检测的技术两类，通常都包括富集和检测两个步骤。由于CTC在外周血中数量稀少，通过富集细胞来提高检测的敏感性很有必要。

常用的CTC检测技术有流式细胞术(flow cytometry，FCM)和逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)。RT-PCR技术因其操作简单、可标记物选择多、特异性好等特点而应用较多。

目前商业化CTC富集和检测相结合的技术主要有Cell Search、Epithelial immunospot(EPISPOT)、CTC-chip等。其中，Cell Search是目前美国食品和药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)唯一批准检测CTC的方法。但是，Cell Search检测价格昂贵、标本用量大(7.5ml)，选用EpCAM作为标志物筛选(阳选法)CTC会对细胞表面不表达EpCAM的CTC造成漏检，且存在CTC数量少时检测重复性差、结果判断主观性强等缺点。EPISPOT是一种基于酶联免疫吸附测定原理的免疫学分析方法，基于阳选法的富集原理和Cell Search存在类似的缺点。CTC-chip作为一种全新的芯片技术，具有灵敏度高、特异性好的优点，但需要特殊的检测设备，且检测成本很高，不适合高通量检测。因此，临床上迫切需要一种特异性高、灵敏度高；通量高；成本低、高效且操作简单的CTC富集和检测技术。

发明内容

本发明的目的在于通过富集循环中的微量肿瘤细胞，而后通过微量核酸提取及合成技术提取富集肿瘤细胞的RNA并进行逆转录，最后通过高灵敏的实时荧光定量PCR技术，检测肿瘤细胞表面多种干细胞标志物完成对肿瘤细胞的检测。

为了达到上述目的，本发明提供了一种循环肿瘤细胞多种标志物联合检测试剂盒，其特征在于，包含：

1)外周血循环肿瘤细胞富集试剂；

2)RNA抽提试剂；

3)RNA逆转录试剂；

4)标志物EpCAM、CD133、CD90和CK19的荧光标记Taqman探针及其特异性引物对；

5)qPCR反应体系试剂。

优选地，所述外周血循环肿瘤细胞富集试剂采用RosetteSep Human CD45 Depletion Cocktail(Stemcell Canada)试剂。

优选地，所述标志物EpCAM、CD133、CD90和CK19的荧光标记Taqman探针及其特异性引物对的各自浓度为10mM。

优选地，所述标志物EpCAM、CD133、CD90和CK19的荧光标记Taqman探针分别为：

EpCAM probe:FAM-ACGGCGACTTTTGCCGCAGCT-TAM；

CD133probe:FAM-ACCAGCGTGAAAACTAGCCTGCGGTC-TAM；

CD90probe:FAM-TCAGCCTGACCCGTGAGACAAAGAAGC-TAM；

CK19probe:FAM-CCGCTCCGGGCACCGATCT-TAM。

优选地，所述标志物EpCAM、CD133、CD90和CK19的特异性引物对分别为：