[发明专利]一种不含胚芽的甜瓜种子全基因组DNA的提取方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种不含胚芽的甜瓜种子全基因组DNA的提取方法。本发明提供的一种不含胚芽的甜瓜种子全基因组DNA的提取方法，利用组织研磨仪对不含胚芽的甜瓜种子进行进行研磨，采用CTAB法提取基因组，解决传统方法需要加液氮冷冻研磨的费时费力和成本较高等问题，而且提取的DNA稳定性较好，纯度和浓度较高。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种不含胚芽的甜瓜种子全基因组DNA的提取方法。

背景技术

甜瓜(Cucumis melo L.)为葫芦科甜瓜属一年生草本植物，是世界范围内广泛种植且多样性较高的重要园艺作物，联合国粮农组织的数据显示，2011年世界范围内的甜瓜产量为两千七百万吨，是重要的农业经济作物,已进入世界十大重要水果之列。我国已有3000多年的甜瓜栽培历史，是世界上最早栽培甜瓜的国家之一，也是目前世界上甜瓜栽培面积最大、产量最高的国家。我国的栽培甜瓜主要分为厚皮甜瓜和薄皮甜瓜两大类，是世界上甜瓜栽培面积最大、产量最高的国家。由于其色、香、味兼具，同时又含有人类营养所必需的各种成分：碳水化合物、蛋白质、脂肪、钙、磷、铁、胡萝卜素、VC、VB、VB2、Vpp等，尤其是VC含量超过牛奶等动物食品的十几倍。甜瓜的果肉味甘、寒、滑，具有止渴、除烦热、利小便之功效；其瓜蒂可以入药，名苦丁香。甜瓜用途广泛，除了可以直接食用外还可以加工成瓜干、瓜脯、瓜酱等。世界范围内，其地位甚至要高于西瓜。

目前，甜瓜DNA提取主要在甜瓜种子培养发芽后利用植株的子叶或者真叶提取DNA，从叶片中提取DNA须经过浸种催芽、幼苗培养等过程，一般要用几周的时间才能进行DNA的提取，费时费力。传统方法中还采用试剂盒进行DNA提取，但此法的成本相对较高。

中国专利CN 103627786 A公开了一种甜瓜种子纯度检验的方法，该方法中公开了甜瓜DNA的提取步骤：a)将甜瓜种子置于营养钵中发芽出苗，等到幼苗有2-3片真叶时，取2.5-3.5cm²的叶片于小研钵中，加入4×CTAB提取缓冲液将其研碎，转入离心管，65℃水浴半小时；b)加入与提取缓冲液等体积的的苯酚-氯仿-异戊醇混合液，12000rpm离心10分钟，吸其上清置于另一离心管，加入冰冻无水乙醇，-20℃冰柜内放置60分钟沉淀DNA；c)12000rpm离心10分钟，弃上清；加浓度为75％的乙醇，静置4分钟去盐，弃去乙醇；d)离心管置于加热通风烘箱中，65℃风干；e)加灭菌双蒸水溶解待用。该方法是将甜瓜种子进行培养发芽出苗，取叶片进行DNA提取，未能解决费时费力的难题。

发明内容

针对以上现有技术的不足之处，本发明提供一种半粒甜瓜种子全基因组DNA的提取方法，采用不含胚芽的半粒甜瓜种子进行DNA提取，解决费时费力和成本高等问题。并且本方法得到的甜瓜基因组DNA稳定性、纯度和浓度均较好。

本发明采取的技术方案如下：

一种不含胚芽的甜瓜种子全基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：

a.取不含胚芽的甜瓜种子，剪碎，研磨，研磨结束后加入CTAB提取缓冲液并进行水浴；

b.加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合液，混匀，离心；

c.吸上清，上清中加入Rnase A孵育；

d.加入氯仿-异戊醇溶液，混匀，离心；

e.吸上清，上清中加入异丙醇，混匀，于-20～-30℃放置30～60min，离心，弃上清；

f.加乙醇溶液清洗，离心，弃上清，吹干；

g.加入TE缓冲液溶解DNA，保存。