[发明专利]对白花泡桐与同属植物之间亲缘关系进行鉴别的方法

说明书

本发明涉及一种对白花泡桐与同属植物之间的亲缘关系进行鉴别的方法，所述方法包括：（a）提取白花泡桐叶片的总DNA；（b）以步骤（a）所提取的总DNA为模板进行PCR扩增，其中，PCR扩增的引物为rpl16引物对和petL‑psbE引物对；（c）提取泡桐属近缘种叶片的总DNA；（d）以与步骤（b）相同的方法，以步骤（c）所提取的总DNA为模板分别进行PCR扩增；（e）对步骤（b）和（d）的扩增产物分别进行序列比对，构建UPGMA系统发育树。

技术领域

本发明属于物种鉴别技术领域，具体涉及利用cpDNA（叶绿体DNA）分子标记对白花泡桐与其同属种亲缘关系进行鉴别的方法。

背景技术

泡桐作为原产我国的优良林木种类，种质资源也极为丰富，形态变异和地理变异类型大量存在，泡桐天然可异花授粉繁育后代的特性，使得泡桐间的杂交极为容易。随着气候的交替以及长时间的反复回交与种间杂交，在种内出现了不同的生态类型，种间积累了大量表型过渡性杂种群集，表现为较为复杂的种间关系；尽管存在的关系复杂，但是就其种间生物学性状和形态学方面所存在的差异都不是很大，这对于研究泡桐属植物系统进化和分类方面来说大大增加了难度，因此，就当前而言，泡桐属的某些种的亲缘关系以及分类地位等所存在的争议还比较大。

在植物中，由于叶绿体DNA属母性遗传，突变率不大，遗传较稳定，进化速率缓慢，且分子量小、结构简单，叶绿体基因间隔区为非编码序列，受自然环境变化的影响极小，可以保存其变异的程度较高，在进行系统位置分析中能够给出较好的分辨能力，这对于阐明属内种间的关系，并为系统位置分析的准确性提供保证。目前已有报道利用cpDNA分子标记进行柿种质鉴定的方法（专利申请号：201610228088.1），然而，针对更为复杂的白花泡桐及其同属植物的亲缘关系，尚无可靠的鉴定方法的报道。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种利用cpDNA（叶绿体DNA）分子标记对白花泡桐与同属植物之间的亲缘关系进行鉴别的方法，这为白花泡桐与同属植物的亲缘关系的鉴定及发育提供了可靠的理论依据，也为该物种的遗传保护提供了理论指导和技术支持。

因此，本发明提供了一种对白花泡桐与同属植物之间的亲缘关系进行鉴别的方法，所述方法包括：

（a）提取白花泡桐叶片的总DNA；

（b）以步骤（a）所提取的总DNA为模板进行PCR扩增，其中，PCR扩增的引物为rpl16引物对和petL-psbE引物对；

（c）提取泡桐属近缘种叶片的总DNA；

（d）以与步骤（b）相同的方法，以步骤（c）所提取的总DNA为模板分别进行PCR扩增；

（e）对步骤（b）和（d）的扩增产物分别进行序列比对，构建UPGMA系统发育树。

本发明的分析结果可作为鉴定白花泡桐与近缘种亲缘关系的依据。

在优选的实施方式中，步骤（a）和步骤（c）的总DNA提取方法采用改良CTAB法，具体步骤为：

（1）称取干燥叶片50mg，加入3%可溶性PVP粉，倒入液氮后研磨成细粉末；

（2）将所述细粉末装入2 mL Eppendorf管中，与管中经过60℃预热的800 µL 2×CTAB提取液混合；

（3）向Eppendorf管中加入60 µL巯基乙醇，温和搅拌，在60℃下预热30 min；

（4）每10-15min轻轻颠倒混合一次，3-5次后将样品放置在室温下；

（5）然后向温度达到室温的样品中加入800 µL氯仿：异戊醇（24：1）混合液，混合均匀后在12 000 r•min^-1下离心15 min；