[发明专利]一种饲料中羟脯氨酸的测定方法及试剂

说明书

本发明涉及一种饲料中羟脯氨酸的测定方法及试剂。所述方法包括如下步骤：将待测样品进行前处理，使所述待测样品中的蛋白质水解；采用离子交换色谱法对蛋白质水解产物中的羟脯氨酸含量进行测定；阳离子交换柱分离所使用的第一洗脱液为：溶剂为水，溶质及其浓度分别为：柠檬酸钠0.02‑0.03mol/L、氯化钠0.075‑0.125mol/L、柠檬酸0.075‑0.125mol/L、乙醇12‑16％(体积百分含量)的溶液。本发明在流动相试剂配制和仪器分析方法方面进行了改进，适用于针对羟脯氨酸的快速检测，该方法能够使羟脯氨酸与其它氨基酸完全分离，具有快速、准确的特点。该方法能够准确分析饲料中的羟脯氨酸，可用于大规模样品检测，适于标准化。

技术领域

本发明涉及羟脯氨酸的检测技术领域，具体说是一种饲料中羟脯氨酸的检测方法及试剂。

背景技术

羟脯氨酸，分子式C₅H₉NO₃，分子量131.13，又名反式-4-羟基-L-脯氨酸，是胶原蛋白特有的氨基酸，在胶原蛋白中含量约为13.4％，在弹性蛋白中含量极少，不存在于其它蛋白中。

动物胶原水解蛋白是将动物毛皮及其制品下脚料等成分粗加工后制成的水解蛋白质，可以作为动物饲料添加使用，是一种廉价蛋白原料。然而，某些非法厂商为提高乳品中蛋白含量，降低生产成本，将廉价的水解动物蛋白掺入乳粉中冒充代替乳蛋白，掺加的动物胶原水解蛋白不但会影响乳品口感和风味，而且其氨基酸组成不合理，易造成乳品营养价值下降，人体吸收利用率降低，严重影响消费者健康。鉴于蛋白质资源的合理利用及相应风险控制，有必要建立一套快速、准确、有效的羟脯氨酸定量分析方法，为相应农产品及食品质量安全提供有力的检测技术支撑。

现行标准对出口食品、肉与肉制品以及乳品等基质中羟脯氨酸的测定进行了规范，其中前处理方法大多采用酸水解法，即：一定质量的样品中加入一定体积6mol/L盐酸溶液，在充氮条件下，于110℃水解22-24h，检测方法多采用比色法、液相色谱串联质谱法等，比色法在特异性、灵敏度方面尚显不足，而液相色谱串联质谱法虽然能够达到较高灵敏度，但检测成本较高，前处理过程需净化，操作较繁琐，不适于大批量样品的筛查检测。

氨基酸分析仪根据经典的茚三酮与氨基酸显色反应，以阳离子交换色谱梯度洗脱各氨基酸组分，经柱后衍生生成的衍生物通过紫外-可见检测器测定，具有特异性好，灵敏度高，自动化操作等特点。该仪器方法与高效前处理技术相结合，能够满足大批量样品的定量分析，然而目前市售的氨基酸分析仪专用流动相价格昂贵，样品测定消耗快，由国外进口的原装试剂一套4000多元，日常检测量大的情况下一周基本用完，成本太高；且仪器分析方法采用18种氨基酸同步分析方法，检测时间较长，无形中提高了样品分析的成本。

发明内容

针对现有技术中存在的羟脯氨酸测定方法样品前处理时间长，检测特异性不高的问题，本发明的目的在于提供一种快速、准确、灵敏度高、重复性好，检测限低并且操作简便的羟脯氨酸的快速检测方法及试剂。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

一种羟脯氨酸的快速检测方法，包括如下步骤：

S1、将待测样品进行前处理，使所述待测样品中的蛋白质水解,获得蛋白质水解产物；

S2、采用离子交换色谱法对蛋白质水解产物中的羟脯氨酸含量进行测定；

所述离子交换色谱法包括：阳离子交换柱分离、柱后茚三酮衍生、和光度法测定的步骤，

所述阳离子交换柱分离所使用的洗脱液中包括：第一洗脱液(即洗脱液pH-1)；

所述第一洗脱液为溶剂为水，溶质及其浓度分别为：柠檬酸钠0.02-0.03mol/L、氯化钠0.075-0.125mol/L、柠檬酸0.075-0.125mol/L、乙醇12-16％(体积百分含量)的溶液。