[发明专利]一种饲料中羟脯氨酸的测定方法及试剂

权利要求书

1.一种羟脯氨酸的快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将待测样品进行前处理，使所述待测样品中的蛋白质水解，获得蛋白质水解产物；

S2、采用离子交换色谱法对蛋白质水解产物中的羟脯氨酸含量进行测定；

所述离子交换色谱法包括：阳离子交换柱分离、柱后茚三酮衍生、和光度法测定的步骤，

所述阳离子交换柱分离所使用的洗脱液中包括：第一洗脱液；

所述第一洗脱液为溶剂为水，溶质及其浓度分别为：柠檬酸钠0.02-0.03mol/L、氯化钠0.075-0.125mol/L、柠檬酸0.075-0.125mol/L、乙醇体积百分含量12-16％的溶液；所述第一洗脱液的pH值为3.25-3.35；

步骤S2中，所述离子交换色谱法使用的洗脱液中还包括：第二洗脱液、第三洗脱液、第四洗脱液和第五洗脱液；

所述第二洗脱液为溶剂为水，溶质及浓度分别为：柠檬酸钠0.02-0.035mol/L、氯化钠0.1-0.15mol/L、柠檬酸0.075-0.15mol/L、乙醇体积百分含量1-3％的溶液；所述第二洗脱液的pH值为3.15-3.25；

所述第三洗脱液为溶剂为水，溶质及浓度分别为：柠檬酸钠0.035-0.05mol/L、氯化钠0.05-0.1mol/L、柠檬酸0.05-0.1mol/L、乙醇体积百分含量0.1-0.3％的溶液；所述第三洗脱液的pH值为3.8-4.2；

所述第四洗脱液为溶剂为水，溶质及浓度分别为：柠檬酸钠0.05-0.15mol/L、氯化钠0.75-1.25mol/L、柠檬酸0.025-0.5mol/L、苯甲醇体积百分含量0.3-1％的溶液；所述第四洗脱液的pH值为4.7-5.1；

所述第五洗脱液为溶剂为水，溶质及浓度分别为：氢氧化钠0.2mol/L、乙醇体积百分含量10％的溶液；

所述阳离子交换柱分离包括柱分析和柱再生，其中的柱分析按照如下梯度洗脱程序依次进行：

S201、第一洗脱液洗脱阳离子交换柱1.5分钟；

S202、第一洗脱液洗脱阳离子交换柱0.1分钟；

S203、第二洗脱液洗脱阳离子交换柱2.9分钟；

S204、第二洗脱液洗脱阳离子交换柱0.1分钟；

S205、第三洗脱液洗脱阳离子交换柱3.9分钟；

S206、第三洗脱液洗脱阳离子交换柱0.1分钟；

S207、第四洗脱液洗脱阳离子交换柱0.3分钟；

S208、第四洗脱液洗脱阳离子交换柱0.1分钟；

S209、第五洗脱液洗脱阳离子交换柱0.1分钟；

所述阳离子交换柱分离中的柱再生按照如下梯度洗脱程序依次进行：

S210、第五洗脱液洗脱阳离子交换柱3.9分钟；

S211、第五洗脱液洗脱阳离子交换柱0.1分钟；

S212、第二洗脱液洗脱阳离子交换柱0.9分钟；

S213、第一洗脱液洗脱阳离子交换柱0.1分钟；

S214、第一洗脱液洗脱阳离子交换柱14.9分钟；

S215、第一洗脱液洗脱阳离子交换柱。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述柱后茚三酮衍生使用的反应液包括反应液R1、反应液R2和反应液R3；

所述反应液R1为二丙二醇独甲醚、茚三酮和硼氢化钠按1L：30g：81mg混合得到的溶液；

所述反应液R2为二丙二醇独甲醚与茚三酮缓冲液按体积比1：1混合得到的溶液；所述茚三酮缓冲液的溶剂为水，溶质及其浓度分别为：乙酸钠328g/L，冰乙酸体积百分含量10％；

所述反应液R3为乙醇与水按体积比1:19混合得到的溶液。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述柱后茚三酮衍生按照如下程序依次进行：

步骤S201～S209的柱后茚三酮衍生使用体积比为1:1的所述反应液R1和所述反应液R2进行；

步骤S210～S213的柱后茚三酮衍生使用所述反应液R3进行；

步骤S214～S215的柱后茚三酮衍生使用体积比为1:1的所述反应液R1和所述反应液R2进行。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤S1按包括如下步骤的方法进行：

向待测样品中加入6mol/L盐酸溶液后通入氮气，然后在微波功率为600-1000W、温度为5-30min内从常温升至150-170℃、再保温10-50min的条件下进行微波水解，然后浓缩蒸干，加入1-3mL0.02mol/L的盐酸溶液混匀、过滤，获得所述蛋白质水解产物。