[发明专利]一种检测EB病毒的多重荧光定量PCR方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测EB病毒的多重荧光定量PCR方法及试剂盒，所述试剂盒包括检测EBNA1，Bam HI‑W基因及人内参基因的检测引物对和探针，其序列依次如SEQ ID NO：1～9所示。本发明通过综合上述EBNA1基因和Bam HI‑W基因两个基因优势并且加上人内参基因做多重荧光定量PCR的方法，即用内参基因来检测标本DNA提取效果可行性，用双目标基因实现对EB病毒精准定性和定量分析，与现有的商用试剂盒相比，具有更高的灵敏度和特异性，且本发明的荧光定量PCR技术具有操作简单、时间短、试剂耗材来源广、成本低、荧光PCR体系试剂通性强等优势，具有较大的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种检测EB病毒的多重荧光定量PCR方法及试剂盒。

背景技术

EB病毒是Epstein和Barr于1964年首次成功地将Bµrkitt非洲儿童淋巴瘤细胞通过体外悬浮培养而建株，并在建株细胞涂片中用电镜观察到疱疹病毒颗粒，认为该病毒是多种恶性肿瘤（如鼻咽癌）的病因之一，它主要感染人类口咽部的上皮细胞和B淋巴细胞。在中国南方鼻咽癌患病人群中大多都检测到有EB病毒基因组存在。故早期检测到EB病毒的存在与鼻咽癌发生早期事件具有高度相关性，所以建立一种特异检测EB病毒存在方法是至关重要的。

目前商品化检测试剂盒或相关研究主要是ELISA检测方法和EB病毒核酸检测方法，前者检测特异性低，假阳性高，对于后者虽然是使用实时荧光定量的PCR特异检测EB病毒的核酸，但是现在的方法一般是使用单一目标区域的定性或定量分析，如单独的EBNA1或Bam HI-W，这样检测的准确性和特异性往往不高，因为EB病毒核酸拷贝数变异大，特别是Bam HI-W序列不同人群拷贝数差异很大，单独使用不能准确定量，但由于其拷贝数一般都在两个拷贝数以上，对早期中EB病毒感染量比较少的人群也能满足检测的灵敏度（10pg/µL都能检测），故比较适合定性分析，而EBNA1区域几乎所有人群都是固定单拷贝数的，即属于低拷贝数的基因，对于早期中EBV感染量比较少的人群检测灵敏度不足，但比较适合用于定量分析。

多重PCR（mµLtiplex PCR），又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应

另外目前现有的研究方法或试剂盒均为精细分类的荧光定量PCR方法。如单重PCRmix只适合一种核酸染料（如SYBR）或者一条Taq man探针的实时荧光定量PCR或者一种试剂盒只适合一类标本的核酸定量分析，如果要做不同标本的荧光定量分析，必须买多种荧光定量PCR试剂盒，使用范围严格受到限制，通用性。而且现有选用单一的EB病毒目标区域的定性定量分析方法或试剂盒都是国外进口的试剂如罗氏，试剂比较昂贵、操作流程复杂、对实验过程操作要求较高、采购周期较长等缺陷会不利于实际科学研究和项目开展。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有EB病毒检测方法准确性和特异性不高，使用范围受限，且操作复杂、成本高等缺陷和不足，提供一种综合上述EBNA1基因和Bam HI-W基因两个基因优势并且加上人内参基因β-actin做多重荧光定量PCR的方法，即用内参基因来检测标本DNA提取效果可行性，用双目标基因实现对EB病毒精准定性和定量分析。

本发明的目的是提供一种用于检测EB病毒的多重荧光定量PCR引物和探针。

本发明的另一目的是提供一种检测EB病毒的多重荧光定量PCR方法。

本发明的再一目的是提供一种检测EB病毒的试剂盒。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：