[发明专利]激活脑胶质瘤U251细胞中LRIG1表达的小分子RNA、筛选方法及其应用

说明书

本发明公开了一种可激活脑胶质瘤U251细胞中抑癌基因LRIG1表达的双链小激活RNA（dsLRIG‑712）及其应用。dsLRIG‑712由21个核苷酸的正义链和反义链构成，每条链的3’端均悬挂突出两个dTdT核苷酸，其余19个核苷酸相互配对。该saRNA分子能特异性激活LRIG1基因的表达，靶基因mRNA和蛋白表达水平均有升高，并抑制脑胶质瘤细胞的增殖和运动能力，达到抑制肿瘤生长的目的，可用于脑胶质瘤的治疗。

技术领域

本发明提供一种可激活脑胶质瘤U251细胞中抑癌基因LRIG1表达的双链小激活RNA(dsLRIG-712)，并将dsLRIG-712用于脑胶质瘤的治疗。

背景技术

RNA激活(RNA activation,RNAa)是由小分子双链RNA靶向作用于基因启动子区域，在转录水平诱导基因表达的现象。而具有激活功能的小dsRNA称之为小激活RNA(smallactivating RNA,saRNA)。早在1969年，Britten等发现,基因组非编码区转录出的RNA能够激活一大类基因的表达，并提出过激活RNA(activator RNAs，RNAa)的概念，但未获证实。直到2006年，saRNA才被Li等正式发现并命名，Li等在应用靶向E-钙黏素基因启动子区的siRNA(dsEcad-302，dsEcad-215)转染前列腺癌PC-3和DU-145时意外发现，目的基因没有发生预期的表达沉默，反而分别上调了14倍和3.8倍。之后，Janowski等将靶向孕酮受体(proges-terone receptor,PR)基因的dsRNA转染乳腺癌T47D和MCF7细胞发现，PR的表达与对照组相比上调了18倍。Huang等通过对非洲绿猴、大猩猩以及小鼠、大鼠的研究发现，saRNAa在哺乳动物细胞中具有保守性，这项研究使建立动物模型并实施saRNA药物治疗的临床前实验成为了可能。

脑胶质瘤是最常见的中枢神经系统原发性肿瘤，具有侵袭性生长的特征，严重威胁人类健康。目前对脑胶质瘤尚无切实有效的治疗方法，使其成为神经外科领域研究重点。LRIG1是近年来新发现的肿瘤抑制基因，在正常人体各组织中均有表达，但在脑组织中的表达水平最高。研究发现LRIG1的表达水平与脑胶质瘤的肿瘤病理级别呈高度负相关，LRIG1的表达水平越低，脑胶质瘤的恶性程度越高。因此，通过激活LRIG1基因的表达可望达到抑制脑胶质瘤发生与发展的目的。

发明内容

本发明针对上述问题提供一种经筛选得到的治疗人中晚期神经胶质瘤的小分子RNA药物。具体如下：

本发明所用的化学合成靶向LRIG1基因启动子的候选dsRNA分子和dsControl购自上海吉玛制药技术有限公司。人神经胶质瘤细胞(U251细胞)购自中国科学院细胞库，使用DMEM培养液购自吉诺生物医药技术有限公司、胎牛血清购自兰州百灵生物技术有限公司，转染试剂turbofect购自美国Thermo公司，Trizol购自美国Invitrogen公司，反转试剂盒购自美国Thermo公司，PCR Mix购自天根生化科技有限公司，全蛋白提取试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司，BCA试剂盒购自武汉科瑞生物技术有限公司，Anti-LRIG1购自美国Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶(HRP)羊抗鼠、HRP羊抗鼠购自武汉科瑞生物技术有限公司，ECL化学发光试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。

一种具有激活LRIG1基因表达的saRNA的筛选方法，包括如下步骤：

(1)dsRNA的设计：dsLRIG1-712为针对LRIG1基因启动子区相对转录起始点-712附近设计的与该段启动子互补配对，长度为21个核苷酸碱基对的dsRNA分子，具体序列为：dsLRIG1-712：Sense：UUU CCC ACC CAA GGU GUG A[dT][dT]；Antisense：UCA CAC CUU GGGUGG GAA A[dT][dT]。