[发明专利]激活脑胶质瘤U251细胞中LRIG1表达的小分子RNA、筛选方法及其应用

权利要求书

1.一种具有激活LRIG1基因表达的小分子RNA在制备治疗人脑胶质瘤药物中的应用，其特征在于：

小分子RNA，即dsLRIG1-712为针对LRIG1基因启动子区相对转录起始点-712附近设计的与该段启动子互补配对，长度为21个核苷酸碱基对的dsRNA分子，具体序列为：dsLRIG1-712：Sense：UUU CCC ACC CAA GGU GUG A[dT][dT]；Antisense：UCA CAC CUU GGG UGG GAAA[dT][dT]。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于 ，激活脑胶质瘤U251细胞中LRIG1表达的小分子RNA的筛选方法包括如下步骤：

(1)细胞的培养与转染：U251细胞生长在含质量分数为10％胎牛血清的DMEM培养液，37℃、5％CO₂培养箱培养，用转染试剂将dsRNA转染入U251细胞；

(2)总RNA的提取及半定量PCR分析：转染72h后收集细胞，用Trizol试剂提取总RNA，以RNA模版，在PCR管中加入Oligo dT，用DEPC水加至刻度线，将反应液置于65-80℃水浴中、5分钟后立即置于冰上1分钟，分别加入5×buffer，核糖核酸酶抑制剂，dNTP mix和逆转录酶，混合均匀，瞬时离心，将混合物置于PCR仪中完成后续反应：37℃5min，42℃60min、70℃10min，反转录为cDNA；

(4)Westernblot：dsRNA转染细胞72h后收集细胞用于蛋白表达的分析，用PBS清洗细胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解后离心收集上清液，BCA试剂盒测定蛋白质溶液的OD值，调整样品的蛋白浓度，actin为内参蛋白，对提取的蛋白进行SDS-PAGE胶电泳，蛋白转膜后，加入脱脂奶粉封闭液封闭、洗膜，按1：1000比例稀释LRIG1一抗，1：2000比例稀释actin一抗，将PVDF膜分别放入含各自一抗的溶液中，一抗4℃孵育过夜，洗膜，按照1：2000比例稀释HRP标记的二抗，将PVDF膜加入稀释好的二抗，室温摇动孵育1h，洗膜；使用ECL化学发光试剂盒显影，检测dsLRIG1-712转染U251细胞后蛋白表达的改变，即可完成筛选具有激活LRIG1基因表达的saRNA。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，以cDNA为模板，扩增目的基因LRIG1和GAPDH，引物序列：LRIG1上游5’-ATCATCACCCAGCCAGAAAC-3’，下游5’-CTACCGTGGTCCCATCCTT-3’；GAPDH上游5’-AACGGATTT GGTCGTATTGGG-3′，下游5′-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3’。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，PCR反应体系如下：

反应参数：94℃预变性5min、94℃变性30sec、55℃退火30sec、72℃延伸45sec、35个循环，72℃充分延伸10min，凝胶电泳检测PCR产物片段，LRIG1预期大小为892bp，GAPD H为230bp。