[发明专利]一种调控细胞内NF-κB活性的基因表达载体及其调控方法和应用

说明书

本发明公开了一种调控细胞内NF‑κB活性的基因表达载体及其调控方法和应用，该载体包含两个序列元件，调控基因表达的启动子序列和启动子下游miRNA编码序列；所述启动子序列由一段NF‑κB诱骗子序列和最小启动子序列组成；所述miRNA编码序列为一段可编码靶向NF‑κB mRNA的miRNA的编码序列。该基因表达载体的转染可温和而有效地降低NF‑κB活性过度活化的细胞内的NF‑κB活性，且对正常细胞的活力无明显影响，从而避免副作用。本发明的基因表达载体的调控方法简单、快速、有效；该基因表达载体用于制备基因治疗NF‑κB过度活化密切相关疾病的NF‑κB活性调控试剂或药物分子，作为一种新的基因治疗试剂。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种调控细胞内NF-κB(kappaB)活性的基因表达载体及其调控方法和应用。

背景技术

核因子kappaB(NF-κB)是一类重要的调控性转录因子，在许多生理和病理过程中起关键作用，如免疫、细胞增殖、凋亡、炎症、尤其是肿瘤发生。一些研究表明许多疾病与NF-κB及其信号通路的异常活化有关。例如，NF-κB在许多人类癌症中异常激活，通过上调抗细胞凋亡基因来促进生存和恶性肿瘤。已经发现，NF-κB的核聚集和高NF-κB靶基因特征导致大多数多发性骨髓瘤细胞系的NF-κB通路富集，并对细胞凋亡敏感。因此，许多制药公司和科学家一直致力于开发用于癌症治疗的NF-κB抑制剂。

化学药物是开发NF-κB活性抑制剂的重要领域。例如。Kim等人用一种新型合成化合物MCAP处理原代小鼠小胶质细胞和BV2小胶质细胞。然后用LPS进行诱导孵育，通过RT-PCR、蛋白质印迹和ELISA分析细胞中诱生型一氧化氮合酶(iNOS)、COX-2、促炎性细胞因子、NF-κB和p38MAPK信号分子的表达，并使用相差荧光显微镜观察小胶质细胞的形态学变化和NF-κB的核易位。结果表明，MCAP可以抑制LPS诱导的iNOS和COX-2的表达，说明MCAP通过抑制NF-κB信号通路，p38MAPK信号通路和促炎反应发挥抗炎作用。但是，遗憾的是这些化学药物的特异性低。

如今，基因治疗成为理想的疾病治疗策略，因为人类的绝大部分疾病均是由基因结构变异或是表达异常引起的，所以最理想的疾病治疗策略就是从基因水平上进行矫正。诱骗子策略和RNA干扰策略属于利用基因治疗的方法来抑制细胞内NF-κB的活性。诱骗子策略是指合成一种与NF-κB的顺式调控元件序列相一致的双链DNA序列，将其导入到细胞中后，此DNA序列就可以和活化后的NF-κB特异性的结合，以此可以干扰活化后的NF-κB进入到细胞核，减少其与靶基因上的NF-κB结合位点的特异性结合，从而达到抑制NF-κB活性调控靶基因表达的目的。报道发现诱骗子序列通过抑制NF-κB的活性来调节NF-κB相关靶基因的表达，导致破骨细胞凋亡。利用合成的诱骗子可通过直接抑制NF-κB活性来抑制纤维肉瘤细胞生长。一旦靶向NF-κB的合成诱骗子被引入类风湿患者的滑膜细胞，细胞因子和粘附因子的表达都减少了，并且滑膜细胞的增殖也受到抑制。N-κB诱饵可以同时调控由相同的顺式调节元件控制的许多基因。同时，诱骗子具有高度的特异性和相对简单的合成。然而，NF-κB诱骗子容易被身体中的一些酶降解，需要重复和高剂量给药以维持NF-κB及其信号通路的活性抑制。