[发明专利]一种去棕榈酰化PD-L1蛋白质及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种去棕榈酰化修饰PD‑L1蛋白质，其中，PD‑L1蛋白质在272位点氨基酸的半胱氨酸替换为其它氨基酸；通过改变PD‑L1唯一的棕榈酰化修饰位点(Cys272)的半胱氨酸为其它氨基酸，利用基因工程方法构建真核表达载体，使其编码带有Cys272位点突变的PD‑L1蛋白质，在真核细胞中进行过表达和纯化制备得到去棕榈酰化修饰PD‑L1蛋白质。本发明的去棕榈酰化修饰PD‑L1蛋白质可作为标准品，用于验证棕榈酰化检测方法的准确性以及验证调控PD‑L1蛋白质棕榈酰化的方法的有效性，在针对PD‑L1肿瘤免疫相关蛋白的机制和干预研究中具有重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种去棕榈酰化PD-L1蛋白质及其制备方法和应用。

背景技术

恶性肿瘤是我国发病率和死亡率均居前列的一类疾病，近年来临床诊断、手术、放化疗的发展使得一部分恶性肿瘤患者得到早期发现和有效治疗。然而在全世界范围内，寻找新的治疗方法和药物长期以来是肿瘤研究领域的热点。不同于传统的治疗方法，肿瘤免疫治疗能够激活或诱导人体建立起对肿瘤抗原的特异性免疫应答，清除原发或转移的肿瘤细胞，并建立免疫记忆，组织肿瘤的复发、耐药和转移。程序性细胞死亡分子1(PD-L1)是免疫检查点蛋白之一，其在限制T细胞活性中起主要作用，所属T细胞提供了主要的免疫抵抗机制，通过这种限制作用肿瘤细胞能够躲过免疫监视。在活化的T细胞上表达的PD-1与在肿瘤细胞上表达的PD-L1的相互作用对免疫应答起负调节并减弱抗肿瘤免疫力。PD-L1在肿瘤上的表达与黑色素瘤、肺癌、食管癌和其它类型的癌症的生存率下降相关，该通路可作为新的有前途的肿瘤免疫治疗靶点。

目前，已经有制药公司已经开发出了靶向PD-L1的抗体，在不同的肿瘤类型中显示出临床活性。PD-L1抗体通过在细胞表面结合PD-L1，阻断其与PD-1的结合并激活T细胞的免疫应答，提高抗肿瘤免疫力。但是，目前基于抗体的免疫检查点阻断疗法仍存在很大挑战及不足之处，例如有部分肿瘤患者对PD-L1抗体治疗反应不佳，此外治疗的效果还可能随着用药时间的延长而有所降低。因此对研究靶向PD-L1的新方法存在需求，以期使肿瘤患者获得更有效的治疗。

现有技术关于PD-L1蛋白质棕榈酰化修饰的存在、可发生棕榈酰化的氨基酸位点、棕榈酰化修饰对PD-L1蛋白质的表达和细胞内定位的影响等均未见公开。我们通过整合的生物信息学分析、蛋白质质谱检测、Click-IT棕榈酰化特异性免疫沉淀联合免疫印迹等方法，发现并证实了272位点半胱氨酸(Cys)可以发生棕榈酰化修饰，并且是PD-L1蛋白质唯一可以发生棕榈酰化修饰的位点；同时，棕榈酰化对于PD-L1表达量的升高、细胞膜和高尔基体的定位均有显著的影响。因此，棕榈酰化的调控可能成为靶向PD-L1肿瘤免疫相关蛋白的新途径，为肿瘤的免疫治疗提供新的方法。

发明内容

鉴于现有技术的上述不足，本发明的目的在于针对新发现的PD-L1的棕榈酰化修饰及其对PD-L1在癌细胞中表达和定位的显著影响。提供一种去棕榈酰化PD-L1蛋白质、制备方法及用途。

为实现上述目的，本发明的第一方面提供一种去棕榈酰化PD-L1蛋白质，如下所示：

一种去棕榈酰化PD-L1蛋白质，其中，PD-L1蛋白质氨基酸序列中在272位点氨基酸的半胱氨酸替换为其它氨基酸；

进一步地，所述去棕榈酰化PD-L1蛋白质，其氨基酸序列中，氨基酸可任意被取代、可缺失或添加一个或几个氨基酸；

进一步地，所述其它氨基酸选自丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丝氨酸、脯氨酸、苏氨酸、酪氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、甘氨酸；

进一步地，所述PD-L1蛋白质氨基酸序列中在272位点其他氨基酸为丙氨酸；

本发明第二方面提供一种去棕榈酰化PD-L1蛋白质的制备方法，包括以下步骤：