[发明专利]一种海藻糖合酶突变体及其在制备海藻糖中的应用

说明书

本发明公开了一种海藻糖合酶突变体及其在制备海藻糖中的应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明将Thermobifida fusca YX的海藻糖合酶活性中心附近第289位的谷氨酸突变成甘氨酸得到突变体E289G；将第295位的组氨酸突变成天冬酰胺突变体H295N；将第344位的甲硫氨酸突变成赖氨酸突变体M344K；将第367位的甲硫氨酸突变成亮氨酸突变体M367L，并在H295N基础上进行双突变得到突变体H295N/E289G、H295N/M344K、H295N/M367L、H295N/M344K/M367L。突变体实现了底物中即使含有一定的葡萄糖，海藻糖合酶制备海藻糖的转化效率依然不会受到很大的影响，具有较高的工业价值。

本申请是申请号为：201510210023.X，申请日为：2015年4月28日，申请名称为：一种海藻糖合酶的突变体及其制备方法和应用的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种海藻糖合酶突变体及其在制备海藻糖中的应用，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

海藻糖是一种安全无毒以1,1-糖苷键构成的非还原性二糖，有三种异构体即(α,α)、异海藻糖(β,β)、新海藻糖(α,β)，一般以二水化合物的形式存在。与蛋白质或者氨基酸共同加热，不会产生美拉德反应，并且在酸性、碱性、高温、超低温环境都能保持一定的稳定性。其独特的生物活性，使得海藻糖得到广泛的应用。大量的研究表明，海藻糖是单细胞生物、动物组织和器官、蛋白质、生物膜、医药制剂等的保护剂，能够抑制脂质酸化、淀粉老化、蛋白质变性，具有矫味矫臭功能、搞玻璃转化温度、低吸湿性、低甜度等性质，能够将其应用到医药业、农业、生化制品业、化妆品行业、食品加工业。

早期商业化的海藻糖是从酵母中提取的。1990年价格约700美元/kg，提取率过低，成本过高。1995年日本利用双酶法实现工业化生产，使得海藻糖价格由原来的2万日元/kg大幅降到1997年的280日元/kg。中国2002年首次以双酶法实现海藻糖的产业化，价格79元/kg。双酶法以淀粉为原料，在麦芽寡糖基海藻糖水解酶和麦芽寡糖基海藻糖合成酶的作用下生成海藻糖，此法生产工艺复杂，难以推广，目前全世界只有几个公司能生产。而海藻糖合酶以麦芽糖为底物，一步转化生成海藻糖，是相对经济的生产方法，但仍有很多问题需要研究解决，其中海藻糖合酶是关键。因此，挖掘适合生产海藻糖的海藻糖合酶对于推动海藻糖的大规模工业化、降低产业成本具有重大的意义。

麦芽糖可以通过水解淀粉得到，生产过程中会产生一定的葡萄糖，工业化生产海藻糖使用纯的麦芽糖成本过高。海藻糖合酶除了转苷作用外还有微弱的水解反应，由此生成副产物葡萄糖。本发明所使用的来源于Thermobifida fusca YX海藻糖合酶若以工业级的麦芽糖(含有1％-10％的葡萄糖)为底物，海藻糖合酶酶转化率会受到一定的影响。本发明通过定点突变对海藻糖合酶进行改造，削弱葡萄糖对酶转化的抑制作用。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供一种海藻糖合酶的突变体，其活性中心位点附近氨基酸发生突变，得到受葡萄糖抑制影响减弱的海藻糖合酶。所述突变体包括含有一个、两个或三个相对于Thermobifida fusca YX海藻糖合酶活性氨基酸残基的取代。

所述海藻糖合酶的亲本的氨基酸序列与NCBI数据库中的Thermobifida fusca YX海藻糖合酶一致(登录号WP_011291031.1)。

所述突变体是将亲本海藻糖合酶的第289位的谷氨酸(Glu)突变为甘氨酸(Gly)，命名为E289G；或将第295位的组氨酸(His)突变成天冬酰胺(Asn)，所得突变体命名为H295N；或将第344位的甲硫氨酸(Met)突变成赖氨酸(Lys)，所得突变体命名为M344K；或将第367位的甲硫氨酸(Met)突变成亮氨酸(Leu)，所得突变体命名为M367L。