[发明专利]一种人体免疫复合因子的制备方法及应用

说明书

本发明提出了一种人体免疫复合因子的制备方法，包括人外周血单个核细胞的分离、人外周血单个核细胞的培养与诱导、细胞的纯化除杂以及细胞的破碎和产物的提取。其作用机理是将外周血(包括脐血)中的单个核细胞(主要是淋巴细胞)培养扩增，在一定条件下诱导其产生有效的免疫复合因子，包括多肽及各种小分子物质，所以临床效果更明显，作用更全面。另外，由于排除了外源性细胞的输入，输入后不会引起发热、乏力、肌肉酸痛等副作用，所以安全性高，免疫功能更全面。本发明制备的单核细胞诱导冻融提取物，使用方便、易于保存和运输，可同时作为提高机体免疫力、抗衰老及治疗肿瘤等疾病的有效生物制剂。

技术领域

本发明涉及生物免疫领域，特别是指一种人体免疫复合因子的制备方法和应用。

背景技术

PBMC(peripheral blood mononuclear cell)，外周血单个核细胞，顾名思义，其主要细胞类型为血液里具有单个核的细胞，包括淋巴细胞(T/B)、单核细胞、吞噬细胞、树突状细胞和其他少量细胞类型，其中淋巴细胞占很大一部分。

现有生物免疫治疗领域的技术，主要是通过对干细胞、间充质干细胞、淋巴细胞等基因改造，再将这些细胞输入机体，包括自体免疫细胞或异体过继性免疫疗法的细胞输入治疗，包括细胞因子诱导后的杀伤细胞(即CIK)、各种基因转染改造后的免疫细胞、免疫检查点阻断剂(CTLA-4阻断剂、PD-1/PD-L1阻断剂等)、树突状细胞疫苗等都是已知的免疫领域较为成熟的技术。目前干细胞、PD-1、PD-L1及CAR-T等是生物免疫治疗领域的热点。上述技术，由于外源性基因改造及借助病毒转染后的细胞输入，可能会带来明显的副作用(包括发热、乏力、肌肉酸痛等)，使得产品安全性有待提高；另外，治疗的效果以及应用范围往往难以确定。干细胞、PD-1及CAR-T等生物治疗，是诱导细胞功能单向分化，属于特定的靶向治疗，所以作用单一。特别是细胞输入机体后，细胞内的活性物质并不能够从细胞核与细胞质中完全释放出来，甚至可能被细胞内的各种酶分解，最终透过细胞膜释放的有效物质减少，从而达不到理想的治疗效果。

发明内容

本发明所要解决的技术问题，就是提出一种人体免疫复合因子的制备方法。此外，本发明还提出了上述人体免疫复合因子作为免疫制剂在临床治疗上的应用范围。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种人体免疫复合因子的制备方法，包括如下步骤：

1)人外周血单个核细胞的分离：通过仪器单采或人工抽取人外周血，肝素抗凝处理及Ficoll密度梯度离心法分离得到单个核细胞；

2)人外周血单个核细胞的培养与诱导：将所得的单个核细胞重悬并置于AIM-V无血清培养基培养，调整细胞浓度为1×10⁶个/mL，同时加入植物血凝素使得植物血凝素在体系中所占含量为10-100ug/mL，继续置于37℃、5％的CO₂孵箱中培养，以后隔日补加AIM-V无血清培养液，培养5-10天，使细胞浓度至少达到1×10⁷个/mL，收获细胞；

3)细胞的纯化除杂：将收获的细胞用生理盐水洗涤三次，以除去培养液中所有成分；

4)细胞破碎和产物收集：在收集的细胞中加入生理盐水，将细胞稀释成2×10⁶个/mL悬液，经超声粉碎并重复冻融裂解处理后，离心收集上清即为免疫复合因子，冷冻保藏即可。

作为优选地，所述外周血包括脐血。

作为优选地，所述步骤2)和步骤4)中离心操作的条件为4℃、2000rpm/min，离心时间为5分钟。

作为优选地，所述步骤2)中，加入的植物血凝素在体系中所占含量为50ug/mL。

作为优选地，所述步骤3)中，用生理盐水洗涤后的细胞需检测以排除细菌、真菌、内毒素污染。