[发明专利]检测犬艾利希体的引物对、套组及方法

说明书

【技术领域】

本申请系关于一种犬艾利希体的快速诊断，尤指一种检测犬艾利希体的引物对、套组及方法。

【先前技术】

犬艾利希体(Ehrlichia Canis)为一小型、杆状、细胞内寄生且由壁虱传播的病原体，革兰氏染色呈阴性，属于α-变形菌(α-proteobacterium)，且主要由棕色犬壁虱(brown dog tick，学名为Rhipicephalus sanguineus)所传播。此病原体呈微菌落方式寄生在以薄膜区隔的细胞内液泡，且主要寄生在哺乳类宿主的单核细胞及巨噬细胞中。艾利希体(Ehrlichia)与立克次体(Rickettsia)、无形体(Anaplasma)及沃尔巴克氏体(Wolbachia)是非常接近的菌种，且具有类似的细胞内结构。

犬艾利希体最早于公元1935年在阿尔及利亚被发现，且目前所知已广泛分布在美国、欧洲、南美洲及亚洲。犬艾利希体会造成犬只的艾利希体症(ehrlichiosis)，其系经由壁虱传播而感染，而感染的犬只若未受治疗，可能成为无症状的带原者长达数年，且最后因大量出血而死亡。艾利希体症会影响犬只、人类及其他驯养或野生的动物品种。随着全球暖化、壁虱分布区域的扩大及国际旅行的增加，此疾病也可能会散播至过去非流行的区域。

艾利希体症可产生多重有临床症状或无临床症状的表现，使得此疾病的诊断富有挑战性。急性和慢性期以及与其他蜱媒病原体的共同感染，也使得治疗更加复杂。尽管用抗生素治疗且临床症状已解除，通常病原体也无法被完全消除。

由于这些感染通常会造成血小板低下症，因此血小板计数是重要的筛检试验，然而少量的病原体增加了试验的困难度，故此诊断方法缺乏灵敏度。而其他用于犬艾利希体诊断的方法尚包括血液抹片、血清诊断及分子诊断，但前述方法皆有其限制。

利用血液抹片镜检来检测典型细胞内寄生的犬艾利希体之桑葚胚对于艾利希体症的诊断是具有高度专一性的，然而此方法相当费时且不是非常可靠，因为在急性感染期间，桑葚胚在血液抹片中仅有小量的存在，而此镜检的灵敏度仅有约4％。

血清诊断则有助于辨识犬艾利希体抗体的存在，但可能无法侦测出疾病急性期的早期感染。血清诊断的限制更在于交叉反应，尤其常见于艾利希体属(Ehrlichia spp.)及无形体属(Anaplasma spp.)之间。此外，血清诊断也无法区分出是曾经感染(post exposure)或是正在感染(present infection)。

而诊断犬艾利希体最佳的方式便是分子诊断，尤其是利用聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction,PCR)进行检测。聚合酶连锁反应是一种更灵敏且更具专一性的技术，提供了诊断犬艾利希体的另一替代方案。举例而言，由BioinGentech公司所提供的犬艾利希体检测套组(VetPCR Ehrlichia canis Detection Kit)可用来检测犬艾利希体感染，且诊断快速、准确及可靠。然而，此检测套组仍须结合终端PCR侦测方法，例如凝胶电泳(gel electrophoresis)，使得整个检测过程需花费3小时，仍是相当费时及费力。

因此，提供一种可改善现有技术缺点之犬艾利希体诊断方法实为本领域技术人员需要努力的方向。

【发明内容】

本申请的目的在于提供一种用以检测犬艾利希体(Ehrlichia Canis)的引物对，其具高灵敏性及高专一性，以快速且准确的诊断出犬艾利希体感染。

本申请的另一目的在于提供一种用以检测犬艾利希体(Ehrlichia Canis)的套组，其具高灵敏性及高专一性，以快速且准确的诊断出犬艾利希体感染。

本申请的又一目的在于提供一种用以检测犬艾利希体(Ehrlichia Canis)的方法，其具高灵敏性及高专一性，以快速且准确的诊断出犬艾利希体感染。

为达上述目的，本申请之一较广义实施方案为提供一种用以检测犬艾利希体(Ehrlichia Canis)的引物对，包含一顺向引物及一逆向引物，其中，该顺向引物的序列为5’-ATTAATGTACTATGCTCCAAG-3’，该逆向引物的序列为5’-GTTGAGTTTCTTTCTTCTTTAG-3’。该顺向引物及该逆向引物系用于实时聚合酶链锁反应(Real-time PCR)。