[发明专利]一种基于CRISPR-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体及其构建方法和应用。本发明建立的基于CRISPR‑Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体能够快速简单地对猕猴桃基因进行高效的定点突变，弥补了猕猴桃中基因定点编辑技术的空白。实验结果证明：通过农杆菌介导的猕猴桃遗传转化，本发明的基于CRISPR‑Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体成功地对猕猴桃基因AcPDS的两个靶点进行了定点突变，同时引起了白化的表型。

技术领域：

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基于CRISPR-Cas9的猕猴桃基因编辑载体及其构建方法和应用。

背景技术：

创建突变体是基因功能研究和作物遗传改良的最为关键的步骤。传统的诱导基因突变的方法包括随机诱变、T-DNA/转座子插入。近些年发展出来的位点特异性的核酸酶，包括锌指结构(ZFs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)成功地诱导了定点突变，传统的诱变方式盲目性高、耗时耗力而且效率非常低。同时由于锌指核糖核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)都需要针对特定的基因重新设计对应的内切酶最后与FokI内切酶进行融合，这个构建过程非常繁琐同时费用非常高。相比较而言，最近建立的定点突变的体系CRISPR-Cas9设计简单、效率高、费用低、应用范围广，已经广泛应用于多个物种的定点突变。

CRISPR-Cas系统是来源于细菌和古细菌的获得性免疫系统，主要用于清除噬菌体等外源DNA。该系统主要包括两个成分crRNA和Cas蛋白，crRNA和Cas蛋白形成有功能的复合物，复合物识别靶标序列下游的PAM序列并切开特异的位点。目前CRISPR-Cas系统可以分为6大类，其中II型系统仅需要一个Cas9蛋白、crRNA和tracrRNA就可以发挥定点切割的功能。相关研究表明可以用一条人工合成的sgRNA来替代crRNA和tracrRNA，这样就进一步简化了该系统，同时成功将该系统用于植物的定点基因编辑。近几年，该系统已经成功被应用于拟南芥、水稻、烟草、高粱、玉米等，但是目前CRISPR-Cas9系统在猕猴桃上的研究与应用仍是一边空白。

猕猴桃营养丰富、富含维生素C、经济价值高，已逐渐成为一种重要的经济作物。为了更好的研究基因功能和遗传改良，需要准确的建立定点突变的基因突变株系，目前尚无关于猕猴桃的定点突变的系统，因此建立高效的针对猕猴桃的CRISPR/Cas9系统并将其应用于猕猴桃的基因编辑显得尤为重要。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种基于CRISPR-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体及其构建方法和应用。

本发明的第一个目的是提供一种靶向猕猴桃基因AcPDS的sgRNA表达盒，其特征在于，所述的sgRNA表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的第二个目的是提供一种基于CRISPR-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体，其特征在于，包括载体pYLCRISPR/Cas9P-35S-N片段和通过无缝克隆插入到载体pYLCRISPR/Cas9P-35S-N的AscI酶切位点的上述的sgRNA表达盒。

本发明的第三个目的是提供一种含有上述的基于CRISPR-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体的细菌。

所述的细菌优选为农杆菌EHA105。

本发明的第四个目的是提供一种猕猴桃基因AcPDS定点突变试剂盒，其特征在于，包含上述的靶向猕猴桃基因AcPDS的sgRNA表达盒或上述的基于CRISPR-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体或上述的细菌。

本发明的第五个目的是提供一种含有上述的基于CRISPR-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体的转化体。

本发明的第六个目的是提供一种上述的基于CRISPR-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：