[发明专利]一种基于CRISPR-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种靶向猕猴桃基因AcPDS的sgRNA表达盒，其特征在于，所述的sgRNA表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.一种基于CRISPR-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体，其特征在于，包括载体pYLCRISPR/Cas9P-35S-N片段和通过无缝克隆插入到载体pYLCRISPR/Cas9P-35S-N的AscI酶切位点的权利要求1所述的sgRNA表达盒。

3.一种含有权利要求2所述的基于CRISPR-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体的细菌。

4.根据权利要求3所述的细菌，其特征在于，所述的细菌为农杆菌EHA105。

5.一种猕猴桃基因AcPDS定点突变试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的靶向猕猴桃基因AcPDS的sgRNA表达盒或权利要求2所述的基于CRISPR-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体或权利要求3所述的细菌。

6.一种权利要求2所述的基于CRISPR-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以质粒pYLsgRNA-AtU6-1为模板，以引物U6-1-F和U6-1-C作为引物进行PCR扩增，得到含有两个BsaI酶切位点和AtU6-1启动子的片段一；

(2)以质粒pYLsgRNA-AtU6-1为模板，以引物GF和GR作为引物进行PCR扩增，得到含有两个BsaI酶切位点、gRNA scaffold和终止子的片段二；

(3)使用AscI单酶切质粒pYLCRISPR/Cas9P-35S-N，回收后得到线性化的pYLCRISPR/Cas9P-35S-N；

(4)将步骤(1)得到的片段一和步骤(2)得到的片段二与线性化的pYLCRISPR/Cas9P-35S-N混合后进行同源重组反应，得到质粒pHLW-gRNA-Cas9-U6-1；

(5)根据猕猴桃基因AcPDS的序列，设计靶标序列对应的引物crispr-gRNA1-F和crispr-gRNA2-R；

(6)以质粒pYLsgRNA-AtU6-1为模板，以引物crispr-gRNA1-F和crispr-gRNA2-R作为引物进行PCR扩增，回收并纯化得到两端带有BsaI酶切位点、同时含有两个靶标序列的片段三；

(7)将步骤(6)得到的片段三和载体pHLW-gRNA-Cas9-U6-1混合，使用BsaI限制性内切酶和T4 DNA连接酶进行循环酶切连接反应，得到基于CRISPR-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体；

所述的步骤(1)、(2)和(6)中使用的引物序列如下：

U6-1-F：5’-GACCGGTAAGGCGCGAGAAATCTCAAAATTCCGGCAGAACAA-3’；

U6-1-C：5’-CGAGACCGGTCTCTAATCACTACTTCGTCTCTAACCATATAT-3’；

GF：5’-AGAGACCGGTCTCGGTTTCAGAGCTATGCTGGAAACAGC-3’；

GR：5’-AGCTCGAGAGGCGCGAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGAT-3’；

crispr-gRNA1-F：5’-GGTCTCTGATTCAGGTCTGTCCCATCAAGATGTTTTAGAGCTAGAAATAG-3’；

crispr-gRNA2-R：5’-GGTCTCTAAACCTAAGCCAGTATCAGACTCCAATCACTACTTCGTCTCTA-3’。

7.一种猕猴桃基因AcPDS定点突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求2所述的基于CRISPR-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体电转化农杆菌EHA105感受态细胞，筛选阳性克隆，然后侵染猕猴桃叶片，以侵染后的猕猴桃叶片为外植体进行植物组织培养，经抗性筛选，抗性愈伤组织分化再生，用PCR和TA克隆测序验证，确认获得转基因猕猴桃。

8.权利要求1所述的靶向猕猴桃基因AcPDS的sgRNA表达盒或权利要求2所述的基于CRISPR-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体或权利要求3所述的细菌或权利要求5所述的猕猴桃基因AcPDS定点突变试剂盒在猕猴桃基因AcPDS定点突变中的应用。