[发明专利]双拷贝EIP表达载体及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种双拷贝EIP表达载体及其构建方法和应用，涉及生物技术领域，本发明提供的双拷贝EIP表达载体的构建方法，在单拷贝EIP表达载体中弹性蛋白多样肽的N端连接上目标蛋白‑内含肽基因片段，操作简单，实用性强。本发明提供的双拷贝EIP表达载体，与单拷贝EIP表达载体相比，增加了一个拷贝的目标蛋白，达到在一个EIP表达系统中含有两个拷贝的目标蛋白的目的，表达时每产生一个双拷贝EIP融合蛋白分子，裂解后可产生2个目标蛋白分子，使目标蛋白的产量得到大幅提高，增加了一倍。与传统的单拷贝EIP表达载体相比，在得到等量目标蛋白时，本发明提供的双拷贝EIP表达载体具有节约生产成本和时间成本的优点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种双拷贝EIP表达载体及其构建方法和应用。

背景技术

表达载体的构建是目前分子生物学和细胞生物学等实验中最常用的实验手段。目前常用的方法在进行重组蛋白纯化时，常发生亲和层析，严重影响蛋白收率。

利用EIP(elastin-like polypeptide-intein-protein)表达载体进行原核重组表达，可以在重组蛋白纯化时避免亲和层析，成本降低，时间缩短，其中：

ELP(elastin-like polypeptide)：弹性蛋白样多肽，由重复序列VPGXG组成(>100)：X是除脯氨酸以外的任意氨基酸；室温下高度可溶，高温下容易沉淀，转变温度(Tt)为30-40℃(具体Tt取决于链的长度、蛋白浓度和X氨基酸的种类)；

I(internal protein，intein)：内含肽，是指存在于前体蛋白当中的一段序列，在前体蛋白转化为成熟蛋白质的过程中，依靠自剪接功能将内含肽两端的外显肽以肽键连接，同时将自身从前体蛋白中释放出来。内含肽从结构和功能上可以分割为N端和C端，当N端或C端单独存在时不能发生剪接反应，而只有当N端和C端在适合剪接的条件下接触时才能发生剪接反应。内含肽的特点主要为1)切割位点保守；2)具有自我催化酶切的能力；3)蛋白质内含子片段具有核酸内切酶活性。

P：目标蛋白。

现有的EIP表达载体为单拷贝EIP表达载体，EIP表达系统中由于ELP的分子量较大，一般为60kDa以上，当目标蛋白分子量较小时，重组表达获得的目标蛋白相对于ELP来说产量较低，同样会存在成本浪费的问题。

因此，如何开发一种能够提高目标蛋白产量的EIP表达载体，尤其是提高分子量较小的目标蛋白产量的EIP表达载体尤为重要。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种双拷贝EIP表达载体的构建方法，本发明的第二个目的在于提供应用上述构建方法构建得到的双拷贝EIP表达载体，本发明的第三个目的在于提供上述双拷贝EIP表达载体的应用，以缓解现有技术中存在的单拷贝EIP表达载体的目标蛋白产量较低的技术问题。

本发明提供了一种双拷贝EIP表达载体的构建方法，所述构建方法包括：

将目标蛋白基因连接到内含肽基因的N端，得到目标蛋白-内含肽基因片段，将所述目标蛋白-内含肽基因片段连接到单拷贝EIP表达载体中的弹性蛋白多样肽的N端，得到所述双拷贝EIP表达载体。

进一步地，将所述目标蛋白基因和所述内含肽基因扩增后回收，并混合处理，得到所述目标蛋白-内含肽基因片段。

进一步地，所述混合处理为将目标蛋白基因片段和内含肽基因片段混合后升温，使其变性，然后退火，得到退火产物，在所述退火产物中选取内含肽基因和目标蛋白基因的杂合子片段，加入DNA聚合酶，使单链结构互补为双链结构。

进一步地，所述扩增所用的引物为分别根据目标蛋白基因和内含肽基因设计的含有内切酶位点的特异性引物；所述扩增所用的模板为所述单拷贝EIP表达载体。