[发明专利]双拷贝EIP表达载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种双拷贝EIP表达载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：

将目标蛋白基因连接到内含肽基因的N端，得到目标蛋白-内含肽基因片段，将所述目标蛋白-内含肽基因片段连接到单拷贝EIP表达载体中的弹性蛋白多样肽的N端，得到所述双拷贝EIP表达载体。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，将所述目标蛋白基因和所述内含肽基因扩增后回收，并混合处理，得到所述目标蛋白-内含肽基因片段。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述混合处理为将目标蛋白基因片段和内含肽基因片段混合后升温，使其变性，然后退火，得到退火产物，在所述退火产物中选取内含肽基因和目标蛋白基因的杂合子片段，加入DNA聚合酶，使单链结构互补为双链结构。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述扩增所用的引物为分别根据目标蛋白基因和内含肽基因设计的含有内切酶位点的特异性引物；所述扩增所用的模板为所述单拷贝EIP表达载体。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述内含肽基因片段的5’端引物含有17-23bp的延伸，所述17-23bp的延伸的序列与所述目标蛋白基因的3’端的序列相同。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述目标蛋白基因片段的3’端引物含有17-23bp的延伸，所述17-23bp的延伸的序列与所述内含肽基因的5’端的序列相同。

7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，在所述目标蛋白基因的5’端引物和所述内含肽基因的3’端引物中分别含有一个内切酶位点。

8.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，还包括通过限制性内切酶，将所述杂合子片段和所述单拷贝EIP表达载体消化，回收消化产物，混合后进行连接反应，构建双拷贝EIP表达载体，将所述双拷贝EIP表达载体转化大肠杆菌，筛选阳性克隆。

9.一种双拷贝EIP表达载体，其特征在于，应用权利要求1-8任一项所述的构建方法构建得到。

10.如权利要求9所述的双拷贝EIP表达载体在扩增目标蛋白中的应用。