[发明专利]一种靶向清除细菌耐药性质粒的CRISPR-Cas9系统及应用

说明书

本发明公开了一种gRNA序列，所述序列在CRISPR‑Cas9系统中能够以细菌中的耐药性质粒特定位点为靶序列进行DNA序列的编辑，所述gRNA序列如SEQ ID NO:1和/或2所示。本发明还公开了所述gRNA序列的CRISPR‑Cas9系统，以及所述CRISPR‑Cas9系统在制备治疗耐药性细菌感染药物中的应用。本发明提供的CRISPR‑Cas9系统能够靶向NDM‑1和MCR‑1两种超级耐药基因，使所述两种耐药基因能够同时被消除，保证了碳青酶烯类和粘菌素类抗生素的使用效果。

技术领域

本发明公开了一种靶向清除细菌耐药性质粒的CRISPR-Cas9系统。

背景技术

在世界范围内，每年有70万人死于细菌抗生素耐药问题，死亡病例主要来自亚洲和非洲。而在中国，每年就有超过8万人死于耐药菌感染。据英国抗菌药物耐药评估委员会估计，如果目前的情况不能得到改善，到2050年，全球将有1000万人遭遇抗菌素耐药问题，多于目前癌症死亡人数。细菌耐药问题不仅严重影响人类健康，也会导致经济损失。最近世界银行和联合国粮农组织的报告指出，如果2050年仍未解决抗生素耐药性问题，全球年度GDP将下降约1.1％-3.8％，等同于2008年金融危机的影响。更为严重的是，细菌耐药基因造成的抗生素失效不仅仅带来临床上感染治疗的困难，细菌耐药性的快速流行和传播使得局面更加难以控制。随着交通工具的进步和不同地区之间交流的增加，细菌耐药基因可以在全球范围扩散。以介导肠道阴性菌耐受碳青酶烯类抗生素的blaNDM基因为例，这种基因在2010年首次从印度治疗的病人身上分离出来，短短几年内变蔓延至全球多个国家和地区。截止2014年，至少66个国家和地区报告检出有NDM家族耐药基因。另外，blaNDM不仅在地区间扩散，生物层面上还能在不同菌种间扩散。到2014年，超过40种细菌中检测出了blaNDM基因，大部分属于肠道菌群，也在致病菌中检出。

耐药基因流行的最主要原因是其往往能定位于细菌的转移性质粒。质粒是细菌细胞里除了染色质以外能够储存遗传信息环状DNA分子，它能够自主进行复制并且在同一生活环境中的菌株和菌种间通过转化、接合等方式进行转移。再以blaNDM-1为例，从不动杆菌检出的blaNDM-1主要定位质粒。而基因周围结构分析结果显示该基因定位在具有转移功能的大片段转座结构Tn125上，使得该基因可以转座至多种细菌质粒，极易在不同菌株和菌种间发生水平转移。近年来耐药基因不断向烈性病原菌扩散，导致了超级耐药烈性病原菌的出现。发表在《自然·遗传学》杂志的一项大型国际研究发现，多重耐药的伤寒“超级细菌”已经在全球传播。《柳叶刀·传染病》发表文章表明blaNDM-1超级耐药基因可以在多种细菌间转移，已发现11种新的含有blaNDM-1基因的细菌，其中包括常见的烈性病原菌霍乱弧菌、志贺菌和沙门菌。

在耐药危机局面下，新型抗生素的研发远远落后于耐药基因进化的速度，目前主要的策略包括合理使用抗生素、循环用药以及策略性更换抗生素等方法。然而广谱耐药细菌的出现以及抗生素的肝肾副作用等因素使得现有的抗生素种类难以应对目前的局面。亟需新的治疗方案来解决愈演愈烈的细菌耐药问题，并且需要新的技术来阻断耐药基因的水平转移。因而直接针对病原菌携带的耐药基因进行清除以消除细菌耐药性显得至关重要。

CRISPR-Cas系统是原核生物获得性免疫机制，以核酸序列的形式存在于细菌基因组。2012年Matthew等在II型CRISPR系统中发现了一种双链RNA，并将这种双链RNA改造为一种能指导Cas9蛋白对几乎所有DNA序列进行剪切的工具，即CRISPR-Cas9基因编辑技术。CRISPR-Cas9技术仅需设计sgRNA，即将任意一段PAM(Protospacer Adjacent Motif)序列上游22-30bp的靶序列作为CRISPR位点中的spacer，就可实现对含有该靶序列的DNA进行敲除、插入与定点突变等修饰。该技术可以用于靶向清除细菌耐药质粒，使细菌直接丧失耐药能力。CRISPR-Cas9系统的核酸序列可以包装至质粒或噬菌体等可移动基因元件(MobileGenetic Elements，MGEs)上，或者以表达产物sgRNA/Cas9复合体的形式包装至纳米材料载体上，实现CRISPR-Cas9系统的递呈。