[发明专利]聚离子液体磁性纳米复合物及其对痕量循环肿瘤细胞特异性富集和检测的应用

说明书

本发明公开了一种聚离子液体磁性纳米复合物及其对痕量循环肿瘤细胞特异性富集和检测的应用，本发明提供了一种具有高灵敏度，高特异和高准确度的磁性纳米生物探针，并用于对CTCs的分离和富集中。磁珠表面丰富的羧基官能团，能够通过与抗体的氨基化学键合，提高与EpCAM抗体偶联的效率，结合磁珠本身较大的比表面积以及良好的分散性，显著提高了对CTCs的富集效率。同时，聚离子液体本身优良的生物相容性，也显著降低了对细胞的毒性，从而提高了富集后细胞的成活率。

技术领域

本发明属于医学检测领域，具体涉及一种聚离子液体磁性纳米复合物及其应用。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类健康和导致死亡的主要原因之一。肿瘤细胞具有向周围组织侵袭乃至向全身扩散和转移的特性。据报道，约90％的肿瘤患者死于肿瘤侵袭和转移。分子生物学和临床研究结果表明，肿瘤转移在肿瘤发生的早期就已经出现。然而目前肿瘤的发现和临床诊断仍依赖于影像学检查及传统肿瘤标志物的监测，难以在早期即发现肿瘤的转移或复发。因此，为了进一步提高肿瘤治疗的疗效，亟需寻找更有效的疗效和预后检测指标及治疗靶点。研究发现，在肿瘤转移的过程中，在患者的外周血中检测到循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)，因此，对此类肿瘤细胞的早期发现和检测有可能成为发现肿瘤早期转移的一种有效手段，对肿瘤的早期诊断、预后判断及治疗效果评价等方面具有重要的参考价值。

CTCs一般是由原发灶肿瘤细胞入血后转变而来。它在外周血中的数量极其稀少，通常肿瘤患者的血液中CTCs的浓度只有1～10个/mL。因而对CTCs的检测一般首先要经过分离富集的预处理步骤，以去除大部分血液中正常细胞。对CTCs的分离和富集主要分为物理法和生物化学法。物理法主要利用CTCs和血液正常细胞在物理性质方面的差异，如尺寸、密度、悬浮力大小等；生物化学法通常依赖于细胞膜表面的抗原与偶联在分离载体上的抗体相结合，达到分离捕获CTCs的目的。

CellSearch系统是目前唯一通过美国食品药品监督管理局(FDA)批准应用于临床分离富集CTCs的仪器，其主要原理正是利用偶联了EpCAM抗体的磁颗粒与肿瘤细胞表面的抗原相结合，然后在磁场的作用下分离。对富集得到的CTCs，常用有分子生物学法(如定量PCR)和细胞生物学法(如免疫荧光、免疫细胞化学染色等)进行鉴定。然而，该系统的主要缺陷是CTCs群体异源，一些CTCs不表达EpCAM。此外，在该系统中，捕获的CTCs会失去了原有的活力。

四氧化三铁(Fe₃O₄)磁性纳米球是目前细胞分离和富集方面的磁性纳米材料之一。相比于纳米颗粒，Fe₃O₄纳米球(MNs)在磁性分离过程中的响应速度更快，在外加磁场的定向控制下，通过清洗和解吸操作，可将目标物从多组分环境中快速分离出来，省去了离心、过滤等繁琐的步骤，为复杂体系的分离带来了极大便利。但是，纳米尺寸的Fe₃O₄MNs因其粒径小、磁性强等特点，极易发生团聚，使其很难应用在CTCs的分离和富集方面。

发明内容

本发明的目的是的现有技术的基础上，采用磁性分离法，以羧基聚离子液体(PIL)功能化的四氧化三铁(Fe3O4)磁性纳米球(MNs)为分离载体，以上皮细胞黏附分子抗体(anti-EpCAM)作为血液中CTCs的特异性识别分子，通过将其与MNs进行生物偶联制备免疫磁珠(IMNs)，构建一种可直接用于对乳腺癌、宫颈癌、肝癌等肿瘤细胞中痕量CTCs高效分离、富集、鉴定和检测的纳米生物探针，为恶性肿瘤的早期转移诊断以及预后评估提供重要的参考依据。

本发明的另一目的是提供一种上述纳米生物探针在痕量循环肿瘤细胞特异性富集和检测方面的应用。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

一种能够对痕量循环肿瘤细胞特异性富集或检测的聚离子液体磁性纳米复合物，其特征在于它由如下步骤制备而成：