[发明专利]基于受激发射损耗特性的超分辨率显微成像装置和方法

说明书

本发明公开了一种基于受激发射损耗特性的超分辨率显微成像装置和方法，该成像装置在于沿光束传播方向依次由超连续谱激光源（1）、光纤（3）、二向色镜（6）、激发光束滤光片（7）、损耗光束滤光片（19）、光程调节台（8）、第一偏振分光棱镜PBS（9、20）、相位光栅（11、16、22、27）、第二偏振分光棱镜PBS（18、29）、二向色镜（30）、样品台（31）、发射滤光片（33）、相机（34）组成。本发明提供的成像装置能产生比现有成像技术更小的有效照明光斑，对应的显微成像方法（SSTED‑SIM）与现有技术相比，能实现更高的成像分辨率，抗噪声效果好，成像的强度和分辨率都有较大提高。

技术领域

本发明涉及光学显微镜技术领域，具体涉及一种基于荧光分子受激发射损耗特性的非线性结构化光照明超分辨率显微成像装置及其成像方法。

背景技术

现代的生命科学研究中，显微镜是必不可少的研究工具。然而由于光的衍射，传统的光学显微镜存在分辨率的极限，这个分辨率的极限即为衍射极限，可以由瑞利判据(Rayleigh criterion)给出：R＝0.61λ/NA，其中λ是光的波长，NA是显微物镜的数值孔径，所以衍射极限约为200nm。近年来，出现了各种用于提高光学显微镜分辨率的方法，实现在细胞水平上的超分辨成像能力。

超分辨成像显微技术主要包括三大类：1.随机光学重构显微镜(StochasticOptical Reconstruction Microscopy，STORM)和光激活定位显微镜(Photo ActivatedLocalization Microscopy,PALM)；2.结构光照明显微镜(Structured IlluminationMicroscope，SIM)；3.受激发射损耗显微镜(Stimulated Emission DepletionMicroscopy，STED)。

PALM/STORM的成像原理相同，都是利用荧光分子的随机逐个激发发射荧光光子，通过点扩散函数数字化获得其中心位置，从而突破光波衍射现象对成像分辨率的限制。尽管PALM/STORM采用面探测成像，但每次只对少量荧光分子成像，需要反复激活-淬灭荧光分子进行成像，要获得一幅完整的细胞超分辨图像，一般需要采集1万张图像，数据量大，成像时间很长，这使得实验大多数在固定的细胞上完成，无法进行活细胞研究。

STED显微成像技术受到了特别关注，它是一种从物理上打破衍射光学极限的远场荧光显微技术，可以在活细胞上看到纳米尺度的蛋白质。STED的原理为：首先，使用一束激光在样品表面聚焦产生一个艾里斑，艾里斑区域内的荧光分子激发至激发态，使其发光；然后，再用另一束波长较长的激光在样品表面相同位置区域聚焦产生一个面包圈样的空心光斑，将第一束光斑中的大部分荧光物质通过受激发射损耗过程淬灭至基态。通过限制受激发射抑制的区域，就能获得小于衍射极限的发光点，由此显著地提高显微镜的分辨率。

然而目前，最佳的活细胞高分辨率显微镜成像方法仍然是线性SIM，虽然其分辨率是有限的。显微镜的衍射极限傅立叶域上作为图像的一个低通滤波器，通过切断高频率分量来限制图像的分辨率。SIM采用莫尔条纹原理获得截止频域以外的傅里叶频域分量。在线性SIM中，傅立叶带宽被扩大了2倍，从而使分辨率提高了2倍至约100nm的级别。而非线性SIM则提供了一个无需修改SIM显微镜的方法来提高分辨率，从理论上讲，非线性效应可用于非线性SIM来实现小于100nm的分辨率。最先提出的非线性SIM是基于荧光分子激发态饱和效应的非线性结构光照明显微镜(SSIM)，可以使分辨率达到50nm，之后陆续出现了多种非线性SIM。在多种非线性效应中，STED应用于非线性SIM(STED-SIM)的可行性已经在实践中得以验证。STED效应的切换时间大约在200ps，能实现高帧率采样，进而实现快速成像。非线性SIM则由于非线性效应产生了更高阶谐波分量，能进一步扩展的傅里叶频域带宽。而在扩展傅立叶频带时的信噪比(SNR)是依赖于高次谐波的强度。