[发明专利]无血清冻存液及其在冻存间充质干细胞中的应用

说明书

一种无血清冻存液，包括8v/v％～15v/v％DMSO、85v/v％～92v/v％DMEM基础培养基和营养添加物组成，营养添加物中含有成纤维细胞生长因子、胰岛素、生长激素、转铁蛋白、骨形态发生蛋白4、谷氨酰胺、丙酮酸钠、β‑巯基乙醇、人表皮生长因子、亚硒酸钠、以及多种氨基酸和维生素。本发明的冻存液不含有动物源血清，避免了污染和过敏原风险，临床安全性更高。本发明的无血清冻存液适用于人胎盘源、脐带源、脐血源间充质干细胞冻存，与常规有血清冻存液相比，经本发明冻存液冻存的围产间充质干细胞，复苏后具有高的细胞存活率，贴壁生长状态良好，并能很好地维持其生物学特性。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种围产期间充质干细胞的无血清冻存液及其冻存方法，通过优化冻存液组分及配方，用生长因子及营养物质替代动物血清，以不含外源性血清、能保持细胞良好活性和生物学特征的方式进行间充质干细胞的冻存。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是一类具有自我增殖能力和多向分化潜能的干细胞类型，在特定条件下可以分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肌细胞等。人们最早从骨髓中分离得到MSCs，后来发现肝脏、皮肤、肌肉、软骨、皮肤、外周血等多种组织中也有少量MSCs存在。最新研究表明，MSCs具有支持造血、调节免疫功能、促进损伤组织修复和防治移植物抗宿主病等作用，已成为再生医学和组织工程学领域的重要种子细胞与潜在治疗工具。作为MSCs的最早来源，骨髓中MSCs的含量非常少(约占有核细胞总数的0.001％～0.01％)，在衰老和疾病状况下其数量和分化潜能还会下降，无法保证种子细胞质量的稳定性，且骨髓采集为创伤性过程，获取代价较大。相比之下，围产间充质干细胞(Perinatal Mesenchymal Stem Cells，P-MSCs)为MSCs的科学研究和临床应用提供了新的重要来源。

P-MSCs是指以出生相关组织为来源的间充质干细胞，主要为脐血、脐带和胎盘源间充质干细胞，它不仅具有MSCs的共有特性，如多向分化潜能、低免疫原性、旁分泌作用等，相比于脊髓和其他组织来源，还具有如下优势：首先，其细胞含量丰富，制备方法简单；其次，获取过程为非侵袭性操作，对供者无伤害，同时细菌和病毒感染风险较成体组织来源的间充质干细胞低；再者，由于脐血、脐带、胎盘原本为生物废弃物，作为间充质干细胞来源系变废为宝且不会引起道德伦理问题，尤其适用于开展产业化操作。

1999年～2017年期间，全球注册的干细胞临床研究的6000个项目中，MSCs研究项目占比为4/5。截至2016年12月，我国卫计委备案的13个干细胞临床研究项目中，7项为MSCs研究，其中又有6项为P-MSCs研究，包括其对狼疮性肾炎、小儿脑性瘫痪、脊髓损伤、急性心梗、心衰等重大疾病的防治作用研究，提示间充质干细胞已经成为继胚胎干细胞、造血干细胞后的又一大研究热点，有着巨大的临床价值和广阔的应用前景。因此，为保障中下游MSCs临床研究的有效开展，安全推进其临床应用，MSCs种子细胞的安全性与质量变得尤为重要。

细胞冻存是保存细胞的重要手段，可以使细胞在一定时期内脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，在需要的时候进行复苏用于实验研究或临床应用。因此，细胞冻存技术，尤其是冻存液，对于维持冻存细胞活性，降低细胞损伤至关重要。但现有的MSCs冻存液及方法尚有诸多缺点，例如：含有高比例的胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)，可能增加临床研究与应用中外源性蛋白引起排异反应的风险；另无血清冻存方法，因采用血清替代物，试剂价格昂贵，应用范围受限。如：中国发明专利申请201610936192.6公开了一种脂肪间充质干细胞冻存液，由RPMI-1640培养基、FBS(2％～5％，v/v)、环丁砜、乙醇、乙二醇、丙二醇、吐温、甘油、聚乙烯吡咯烷酮、琼脂粉、海藻糖、青霉素，以及冷冻保护剂羟乙基淀粉或葡聚糖组成。中国发明专利申请CN201510718538.0公开了一种胎盘羊膜间充质干细胞的冻存液与冻存方法，其冻存液由DMSO、基础培养基和FBS(10％～50％，v/v)组成。这些方法的间充质干细胞冻存液中均含有FBS，引入了外源性动物血清。

发明内容