[发明专利]无血清冻存液及其在冻存间充质干细胞中的应用

权利要求书

1.一种间充质干细胞的冻存方法，其特征在于取间充质干细胞，胰酶消化后离心并弃上清，加入冻存液，在-80℃保存过夜后，转入液氮长期冻存，每毫升所述冻存液冻存所述的间充质干细胞密度为0.5～1.0×10⁷个细胞；

所述的冻存液组成为：8v/v％～15v/v％DMSO、85v/v％～92v/v％DMEM，以及

4.5ng/mL～27ng/mL成纤维细胞生长因子，4.5μg/mL～18μg/mL胰岛素，2.7ng/mL～3.5ng/mL生长激素，0.045μg/mL～0.18μg/mL转铁蛋白，0.09ng/mL～0.12ng/mL骨形态发生蛋白4，150mg/L～400mg/L谷氨酰胺，45mg/L～70mg/L丙酮酸钠，23μM～60μMβ-巯基乙醇，10ng/mL～20ng/mL人表皮细胞生长因子，15μM～45μM亚硒酸钠，4.5ng/mL～18ng/mL人血小板生长因子，9.6mg/L～16.8mg/L谷氨酸、9.2mg/L～21.3mg/L丙氨酸、5.06mg/L～7.2mg/L甘氨酸、8.6mg/L～14.7mg/L天门冬氨酸、6.9mg/L～13.2mg/L脯氨酸和6.0mg/L～9.8mg/L丝氨酸，各种所述组分的浓度均为在所述的冻存液中的浓度；

还包括0.18mg/L～0.9mg/L维生素B12、0.1mg/L～0.25mg/L维生素C、10μg/L～90μg/L维生素B6和0.2mg/L～0.6mg/L维生素B2之一种或几种，各种所述维生素的浓度均为在所述的冻存液中的浓度；

所述的DMEM培养基为L-DMEM；

所述的冻存液pH 7.0～8.5。

2.根据权利要求1所述的间充质干细胞的冻存方法，其特征在于所述的间充质干细胞为围产间充质干细胞。

3.根据权利要求1所述的间充质干细胞的冻存方法，其特征在于包括：

首先，用37℃水浴预热的0.25％胰蛋白酶消化贴壁细胞，用DMEM完全培养基终止消化，轻轻吹打细胞，收集到容器中，离心，弃上清；

接着，在细胞沉淀中加入所述的冻存液，用量为0.5～1.0×10⁷个活细胞中加入1mL冻存液，轻轻吹打混匀，转入无菌冻存管中，封存；

最后，将细胞置于-80℃中冻存过夜，之后转入液氮中长期冻存。