[发明专利]叶酸受体α特异性结合肽5及其应用

说明书

本发明涉及一种叶酸受体α特异性结合的短肽及其应用，属于生物技术领域。本发明的多肽序列为MNPYPRTPWPHV。此多肽通过从噬菌体展示文库中筛选获得，可与表达叶酸受体α的肿瘤细胞特异结合，为肿瘤的靶向治疗以及肿瘤影像提供了一种新的靶向分子，具有新药开发的潜在价值。

技术领域：

本发明属于生物技术领域，涉及一种叶酸受体α特异性结合的短肽及其在肿瘤靶向中的应用。

背景技术：

噬菌体展示技术是将外源多肽或蛋白与噬菌体的某种衣壳蛋白进行融合表达，使外源蛋白能展示在病毒颗粒表面，同时使编码外源蛋白的DNA位于该病毒粒子内。随机十二肽噬菌体展示文库是将随机十二肽融合到M13噬菌体次要衣壳蛋白(pIII)上，为一个组合文库。所展示的十二肽表达在pIII的N末端。这就在大量的随机多肽与其DNA编码序列之间建立起了直接的桥梁，再用各种靶分子(抗体、酶、细胞表面受体等)来进行体外筛选获得靶分子结合肽。体外选择程序简单来说就是噬菌体库与固相靶分子共孵育，洗涤去除未结合噬菌体，然后洗脱得到能与靶分子特异性结合的噬菌体。被洗脱的噬菌体还需进行扩增，进行下一轮的结合/扩增循环，来富集特异性结合噬菌体。经3～4轮“淘选”后，通过DNA测序可以得到每个特异性结合的多肽序列。

叶酸受体(folate receptor，FR)是结合并转运叶酸及其衍生物进入细胞的重要转运体，在体内主要以三种亚型存在：FRα、β和γ。叶酸受体α(folate receptorα，FRα)是一种由糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定于细胞膜表面的糖蛋白。已有文献报道，卵巢癌、肺癌、肝癌、乳腺癌等组织中FRα呈高表达，而在正常组织中限制性表达，因此被认为是极具潜力的卵巢癌标志物或肿瘤相关抗原(TAA)；FRα对卵巢癌具有的高度特异性，可作为治疗相关肿瘤的靶点；部分研究也表明，FRα对于卵巢癌的早期诊断具有重要价值。基于此，若能得到与FRα具有较高亲和力的短肽序列，将为肿癌的靶向性治疗和诊断提供新思路。

发明内容

发明目的

本发明的目的在于利用噬菌体展示技术获得一种能与叶酸受体α特异性结合的多肽。该多肽可用于靶向叶酸受体α表达阳性的肿瘤细胞。

技术方案

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

1)噬菌体展示肽库的亲和筛选：以叶酸受体α重组蛋白为靶标，运用噬菌体展示十二肽库进行四轮生物筛选。每轮筛选检测回收率和多克隆ELISA，以判断筛选是否有效；通过单克隆ELISA检测各克隆与叶酸受体α重组蛋白的结合能力；

2)噬菌体阳性单克隆DNA的制备及测序鉴定：根据上述ELISA结果，选择阳性值高的噬菌体单克隆，对其进行扩增后进行测序模块的快速纯化以产生足够纯的模板进行测序，选用-96gIII测序引物送到公司进行测序，分析阳性噬菌体相应展示肽序列；

3)细胞ELISA检测噬菌体克隆与天然细胞表面叶酸受体α的结合：选取FRα表达阳性细胞株SKOV3，并以FRα表达阴性细胞株HepG2为对照，通过ELISA检测噬菌体克隆与细胞株的结合；

4)通过流式细胞术进一步确认噬菌体克隆与FRα表达阳性细胞株SKOV3的结合。

有益效果

本发明提供的FRα结合肽，可特异性结合FRα重组蛋白，同时通过细胞ELISA及流式细胞术实验分析，发现筛选出的噬菌体展示短肽能与细胞表面天然FRα特异性结合，具有潜在的医学和药学价值。

附图说明：

图1.多克隆ELISA；

图2.阳性单克隆与叶酸受体α重组蛋白结合能力的研究。图2A.单克隆噬菌体ELISA筛选阳性克隆(圈出的克隆为叶酸受体α特异性结合肽5展示克隆)；图2B.阳性单克隆与叶酸受体α重组蛋白结合的进一步验证；