[发明专利]启动子pYLG及其在构建高产长链二元酸的热带假丝酵母中的应用

权利要求书

1.启动子pYLG在构建高产长链二元酸的热带假丝酵母中的应用，其特征在于，步骤如下：

（1）PCR扩增制备核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的启动子pYLG片段；

（2）制备核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的甘油激酶GK片段；

（3）将步骤（1）制得的启动子pYLG片段与步骤（2）制得的甘油激酶GK片段进行PCR重叠连接，制得pYLG-GK片段；

（4）以含有Kanr9k质粒的大肠杆菌为模板，进行PCR扩增，得到抗性基因Kanr片段；所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：

Kanr-up:5’-GACCTTCGTTTGTGCGGATCCTGAGGGAGCCACGGTTGAT-3’，

Kanr-down:5’-GAAAAGGGGGACGAGGATCGGTTGAGGCCGTTGAGCAC-3’

（5）将步骤（4）得到的抗性基因Kanr片段通过一步法定向克隆无缝克隆连接至pPICzαA载体，制得重组载体pPICzαA-Kanr；

（6）将步骤（3）制得的pYLG-GK片段通过一步法定向克隆无缝克隆连接至步骤（5）制得的的重组载体pPICzαA-Kanr，制得重组载体pPICzαA-Kanr-pYLG-GK；

（7）将步骤（6）制得的重组载体pPICzαA-Kanr-pYLG-GK经电击转化至热带假丝酵母，筛选阳性菌株，制得高产长链二元酸的热带假丝酵母。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中，PCR扩增引物序列如下：

pYLG-up:5’-TTAGACCACTCTTTTGAGCTCGGTTGAAATGAATCGGCCG-3’，

pYLG-down:5’-ACTACGACGTGGCATTGTTGATGTGTGTTTAATTCAAGAATG-3’，

PCR扩增反应体系如下，总体系为50μl ：

2×HiFi-PCR Master 25μl，10μmol/L浓度的pYLG-up上游引物2μl，10μmol/L浓度的pYLG-down下游引物2μl，解脂耶氏酵母基因组DNA 2μl，ddH₂O补足50μl；

PCR反应程序如下：

95℃预变性5min； 95℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min；-20℃保存。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，PCR扩增引物序列如下：

GK-up:5’-AATTAAATTTTAACAATGCCACGTCGTAGTAGTAA-3’，

GK-down:5’-GAGATGAGTTTTTGTTCTAGAGCTTTATTTTTTTTTGTTCATTAGTTCTAC-3’；

PCR扩增反应体系如下，总体系为50μl ：

2×HiFi-PCR Master 25μl，10μmol/L浓度的GK-up上游引物2μl，10μmol/L浓度的GK-down下游引物2μl，热带假丝酵母基因组DNA 2μl， ddH₂O补足50μl；

PCR反应程序如下：

95℃预变性5min； 95℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min；-20℃保存。