[发明专利]双sgRNA介导的基因精确修饰方法及应用

说明书

本发明公开了双sgRNA介导的基因精确修饰方法及应用，本发明同时使用了2条sgRNA，以CF细胞为模型，针对编码CFTR基因的第508位氨基酸的核苷酸进行定向缺失，获得CFTR第508位氨基酸缺失病人一样的致病基因型，并发现本发明双sgRNA较单sgRNA进行编辑具有更高的效率，本发明为基因疾病的细胞模型构建和基因编辑提供了更为有效的方法。

技术领域

本发明属于基因编辑领域，具体涉及一种双sgRNA介导的基因精确修饰方法及应用，特别涉及一种双sgRNA介导的构建囊肿性纤维化细胞模型的方法及应用。

背景技术

基因编辑技术在农业和医学领域均具有广阔的应用前景,技术方法正在不断改进和创新，主要的改良方向是提高基因编辑的精准程度。目前基因编辑主要依靠锌指核酸酶(ZFN)，TALEN与CRISPR/Cas9三大技术，应用最广泛的是CRISPR/Cas9，它使用1条sgRNA，效率和精度仍需提高。囊肿性纤维化(Cystic fibrosis，CF)是一种遗传疾病，其可能会影响身体多处，其中以肺部和消化系统所受的影响最为严重，白种人最常患上囊肿性纤维化。但是目前针对该疾病仍未有治疗的方法。该疾病的发生主要是由于CFTR基因的突变造成的，其中大约70％的病人是由于CFTR基因编码的第508位氨基酸的核苷酸(CTT)的缺失引起的。随着基因编辑技术的发展，基因编辑技术为这一疾病的治疗提供了新的治疗思路，我们可以通过CRISPR/Cas9等基因编辑技术对突变的CFTR基因进行修复，从而达到从根本上治疗疾病的目的。目前针对人CFTR突变位点的修复虽然有一些研究，然而效率却并不高或者需要使用筛选标记基因。

发明内容

本发明同时使用了2条sgRNA，以CF细胞为模型，针对编码CFTR基因的第508位氨基酸的核苷酸进行定向缺失，获得CFTR第508位氨基酸缺失病人一样的致病基因型，并发现本发明双sgRNA较单sgRNA进行编辑具有更高的效率，本发明为基因疾病的细胞模型构建和基因编辑提供了更为有效的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种用于构建囊肿性纤维化模型的双sgRNA，该双sgRNA的序列为：

sg1:CCUAUGAUGAAUAUAGAUACAGA(SEQ ID NO：1)；

sg508-W:CCAAAGAUGAUAUUUUCUUUAAU(SEQ ID NO：2)。

双sgRNA在制备构建囊肿性纤维化模型的试剂中的应用，该双sgRNA的序列为：

sg1:CCUAUGAUGAAUAUAGAUACAGA(SEQ ID NO：1)；

sg508-W:CCAAAGAUGAUAUUUUCUUUAAU(SEQ ID NO：2)。

进一步的，所述囊肿性纤维化模型为囊肿性纤维化的细胞模型、囊肿性纤维化的动物模型。

一种双sgRNA介导的构建囊肿性纤维化模型的方法，该方法为：将上述所述的双sgRNA同时转染目标细胞或动物，培养30～60h后，即得囊肿性纤维化细胞或动物模型。

进一步的，双sgRNA同时转染目标细胞的转染体系为：10⁶～10⁷个细胞，1～2μgsg1，1～2μg sg508-W，8～12μg Cas9蛋白，8～12μg Oligo，100～150μl电转液。

进一步的，双sgRNA同时转染目标细胞的转染条件为在620V，30ms的条件下进行电转。

一种用于构建囊肿性纤维化模型的试剂盒，该试剂盒中含有上述所述的双sgRNA或/和该双sgRNA的转录模板。

引物组在制备上述所述双sgRNA中的应用，所述引物组的序列为：