[发明专利]基于CILLC-MS的评价GFP基因转染对hPMSCs代谢组学影响的方法

说明书

本发明涉及胎盘来源间充质干细胞代谢物的萃取及检测技术，旨在提供一种基于CILLC‑MS的评价GFP基因转染对hPMSCs代谢组学影响的方法。本发明通过萃取、检测GFP基因转染前后的hPMSCs的胞内代谢物，并对其进行定量，深入分析转染前后的差异性代谢物及差异性代谢途径，从代谢组学角度评估绿色荧光蛋白用于标记和示踪间充质干细胞的生物安全性。本发明首创比较hPMSCs与GFP+hPMSCs代谢组学差异的分析流程，将两种样品制备方法结合用于干细胞代谢物萃取，使细胞内代谢物充分释放。结合CIL LC‑MS用于干细胞胞内代谢物检测，实现了胞内代谢物的精准定量分析，并大大增加代谢产物的鉴定种类。本发明极大地提高了结果的灵敏性，可靠性和重复性，避免了操作上引起的不平行性及偶然性。

发明领域

本发明涉及胎盘来源间充质干细胞代谢物的萃取及检测技术，特别涉及基于同位素标记液相色谱-质谱联用(CIL LC-MS)的评价绿色荧光蛋白基因转染对胎盘来源间充质干细胞代谢组学影响的方法。

背景技术

间充质干细胞(MSCs)作为干细胞家族的重要成员，是一种成纤维样、具有高度可塑性和自我更新能力、并能向多种终末细胞分化的多能干细胞。胎盘为临床废弃物，其胎盘来源间充质干细胞(human placental mesenchymal stem cells,hPMSCs)具有来源丰富、分离方法简便、增殖能力强、低免疫原性、无伦理学限制等优点，已经逐步成为干细胞移植治疗的优势种子细胞。

在再生医学中，绿色荧光蛋白因其光毒性弱、相容性好常被用于标记和示踪细胞，以评估移植细胞在体内的分布及存活情况。但在应用于临床前，需要充分研究绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因转染是否对间充质干细胞的基因组学、转录组学、蛋白组学、代谢组学产生影响以满足不同的需求。既往研究已证实GFP基因转染对胎盘来源的间充质干细胞的存活及分化潜能无显著影响。但是否对代谢组学产生影响，由于间充质干细胞代谢物萃取效率低、检测灵敏性低等原因至今尚未证实。

要研究不同组别细胞代谢水平的变化，必须包含尽可能多的代谢途径，因而是否成功萃取代谢物并检测到大量的代谢产物是关键。目前，有很多方法可以应用于哺乳类贴壁细胞代谢组学分析的样品制备。例如9/1v/v甲醇/三氯甲烷(MeOH/CHCl₃)方法或1/1v/v甲醇/水(MeOH/H₂O)方法。根据检测到的匹配峰(peak pairs)，后者明显高于前者，韦恩图提示有交集但特异性显著。但在用于GFP基因转染前后细胞代谢物的萃取时，单独使用均存在萃取效率欠佳的问题。

发明内容

本发明要解决的问题是，克服现有技术中的不足，提供一种基于CILLC-MS的评价GFP基因转染对hPMSCs代谢组学影响的方法，该方法属于新的间充质干细胞胞内代谢物的萃取及检测方法。

为解决技术问题，本发明是通过以下的技术方案实现的：

提供一种基于CILLC-MS的评价GFP基因转染对hPMSCs代谢组学影响的方法，包括以下步骤：

(1)人胎盘来源间充质干细胞的分离培养与转染

hPMSCs的分离培养：无菌条件下取临床废弃的新鲜胎盘组织，用PBS充分洗涤去血渍后，剪弃胎盘组织表面的膜。将剩下的胎盘组织剪碎，以0.2％四型胶原酶消化，37℃消化1h，过滤，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，收集消化液和冲洗液；洗涤细胞沉淀后，用MSCs专用培养基重悬，置于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱进行常规培养；

GFP转染hPMSCs：当常规培养的hPMSCs的融汇率达50％时，加入商品化重组慢病毒悬液进行转染；转染后继续培养24h，然后用新的培养基换掉旧培养基继续培养3-4d，再加入10μg/mL的嘌呤霉素进行筛选：未转染成功的hPMSCs死亡，成功转染GFP的hPMSCs存活，从而得到表达GFP的胎盘MSCs；