[发明专利]Klenow酶及其表达纯化方法

说明书

本发明涉及一种Klenow酶及其表达纯化方法，通过对含有Klenow酶表达片段的重组工程菌进行诱导培养，并收集诱导培养后的菌体。然后将菌体裂解，得到含有目的蛋白(Klenow酶)的裂解液。在进行Ni离子亲和柱纯化之前，向裂解液中加入阳离子聚合物进行聚合沉降反应，然后向聚合沉降反应后收集的上清液中加入蛋白沉淀剂盐析沉降目的蛋白，从而得到粗产物。粗产物中核酸残留少、杂质少，对Ni离子亲和柱纯化过程的影响较小。这种表达纯化的方法操作简便、快速、成本低，适应于大批量的生产，表达纯化获得的Klenow酶纯度高，满足二代测序对于Klenow酶的纯度要求。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种Klenow酶及其表达纯化方法。

背景技术

Klenow酶(又称Klenow片段、克列诺片段或称克列诺酶，英文名为Klenowfragment或Klenow enzyme)，是DNA聚合酶Ⅰ的大片段。Klenow酶由汉斯·克列诺于1970年用枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)处理大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ时，水解生成的C末端605个氨基酸残基片段。Klenow片段保留了DNA聚合酶I的5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性，但缺少完整酶的5’-3’外切酶活性，常用于填补DNA单链末端成为双链。

随着二代测序的发展与应用，Klenow酶作为二代测序建库的工具酶具有很高的市场价值。现阶段大部分的Klenow酶文献报道都停留在蛋白性质研究，通常是重组表达后进行纯化。一般的Klenow酶的纯化工艺需要经过破菌、硫酸铵盐析、MonoQ离子交换、phenyl疏水层析、Superose12凝胶层析、超滤以及透析共九步，该工艺比较繁琐，得率低，不适用于大规模工业化生产。有研究将纯化工艺缩短至破菌、多次重复硫酸铵盐析、NI-NTA、Sephacryl200凝胶层析五部，多次重复硫酸铵盐析对终产品纯度、比活及回收率上均有一定的提高，但纯度仍然无法满足二代测序对于Klenow酶的纯度要求。

综上，传统的方法表达纯化的Klenow酶纯度较低，难以满足二代测序对于Klenow酶的纯度要求。

发明内容

基于此，有必要提供一种纯度较高的Klenow酶及其表达纯化方法。

一种Klenow酶的表达纯化方法，包括以下步骤：

对含有Klenow酶表达片段的重组工程菌进行诱导培养，并收集所述诱导培养后的菌体；

将所述菌体裂解，得到裂解液；

向所述裂解液中加入阳离子聚合物进行聚合沉降反应，固液分离后收集上清液；

向所述上清液中加入蛋白沉淀剂，盐析沉降后得到粗产物；以及

利用Ni离子亲和柱纯化所述粗产物，得到所述Klenow酶。

在一个实施方式中，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺，所述聚乙烯亚胺与所述裂解液的质量比为0.1～1:100。

在一个实施方式中，所述向所述裂解液中加入阳离子聚合物进行聚合沉降反应的操作包括：

将所述阳离子聚合物溶解在溶剂中，配制形成阳离子聚合物溶液；以及

将所述阳离子聚合物溶液滴加到所述裂解液中，并搅拌混匀。

在一个实施方式中，还包括构建所述含有Klenow酶表达片段的重组工程菌的操作：

以Klenow酶的基因编码序列作为扩增模板，并加入上游引物和下游引物后进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，其中，所述上游引物带有EcoRI酶切位点，所述下游引物上带有Hindlll酶切位点；

将所述PCR扩增产物用EcoRI酶和Hindlll酶双酶切处理，得到所述Klenow酶表达片段；