[发明专利]Klenow酶及其表达纯化方法

权利要求书

1.一种Klenow酶的表达纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

对含有Klenow酶表达片段的重组工程菌进行诱导培养，并收集所述诱导培养后的菌体；

将所述菌体裂解，得到裂解液；

向所述裂解液中加入阳离子聚合物进行聚合沉降反应，固液分离后收集上清液，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺，所述聚乙烯亚胺与所述裂解液的质量比为0.1~1:100；

向所述上清液中加入蛋白沉淀剂，盐析沉降后得到粗产物；以及

利用Ni离子亲和柱纯化所述粗产物，得到所述Klenow酶。

2.根据权利要求1所述的Klenow酶的表达纯化方法，其特征在于，所述向所述裂解液中加入阳离子聚合物进行聚合沉降反应的操作包括：

将所述阳离子聚合物溶解在溶剂中，配制形成阳离子聚合物溶液；以及

将所述阳离子聚合物溶液滴加到所述裂解液中，并搅拌混匀。

3.根据权利要求1所述的Klenow酶的表达纯化方法，其特征在于，还包括构建所述含有Klenow酶表达片段的重组工程菌的操作：

以Klenow酶的基因编码序列作为扩增模板，并加入上游引物和下游引物后进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，其中，所述上游引物带有EcoRI酶切位点，所述下游引物上带有Hindlll酶切位点；

将所述PCR扩增产物用EcoRI酶和Hindlll酶双酶切处理，得到所述Klenow酶表达片段；

将所述Klenow酶表达片段插入到经过EcoRI酶和Hindlll酶双酶切处理后的表达载体中，得到重组载体；以及

将所述重组载体转入基因工程菌中，得到所述含有Klenow酶表达片段的重组工程菌。

4.根据权利要求3所述的Klenow酶的表达纯化方法，其特征在于，所述Klenow酶的基因编码序列的碱基序列如SEQ ID No.1所示，所述上游引物的碱基序列如SEQ ID No.2所示，所述下游引物的碱基序列如SEQ ID No.3所示。

5.根据权利要求1所述的Klenow酶的表达纯化方法，其特征在于，所述将所述菌体裂解，得到裂解液的操作包括：

用裂解缓冲液重悬所述菌体，得到重悬液，其中所述裂解缓冲液中含有终浓度为15mmol/L~25 mmol/L的Tris、终浓度为0.05mmol/L~0.15 mmol/L的EDTA和终浓度为40mmol/L~60mmol/L的NaCl，所述裂解缓冲液与所述菌体的体积比为2~10：1；以及

对所述重悬液进行超声破碎，固液分离收集上清，得到所述裂解液。

6.根据权利要求1所述的Klenow酶的表达纯化方法，其特征在于，所述利用Ni离子亲和柱纯化所述粗产物的操作包括：

将所述粗产物溶解在结合缓冲液中，加入到所述Ni离子亲和柱中，所述结合缓冲液中含有终浓度为15mmol/L~25mmol/L的Tris和终浓度为300mmol/L~600mmol/L的NaCl，所述结合缓冲液与所述粗产物的体积比为2~5：1；

用浓度梯度的咪唑溶液洗涤所述Ni离子亲和柱，收集含有Klenow酶的洗脱液。

7.根据权利要求6所述的Klenow酶的表达纯化方法，其特征在于，所述收集含有Klenow酶的洗脱液的操作之后，还包括：用平衡缓冲液对所述含有Klenow酶的洗脱液进行缓冲液置换，所述平衡缓冲液中含有终浓度为30mmol/L~50mmol/L的Tris、终浓度为0.1mmol/L~0.5mmol/L的EDTA和终浓度为1mmol/L~5mmol/L的DTT。