[发明专利]一种用于检测细毛羊皮肤毛囊基因表达的特异性引物组合

说明书

技术领域

本发明属于生物基因领域，尤其涉及一种用于检测细毛羊皮肤毛囊基因表达的特异性引物组合。

背景技术

Ephrin为Eph受体家族的配体成员，主要表达于细胞表面，Ephrin配体有8个成员，根据它们与细胞膜的附着方式，将其分为EphrinA和EphrinB两个亚族。其中EphrinA亚族有5个成员，即EphrinA1-A5。

Suo等研究发现，给小鼠喂食高水平的膳食维生素A能增强Wnt信号从而激活毛囊干细胞，成年小鼠受伤皮肤过量表达Wnt可以增加再生毛囊的数量，而Wnt的受体卷曲蛋白1或2的激活能刺激Ephrin A3的表达。Yamada等研究还发现EphrinA3在雄激素性脱发患者的毛乳头细胞中的表达量明显下降。EphrinA3的表达在出生后6天的小鼠上升，14天时达到高峰，在生长期的晚期突然下降，而在第二个生长期的初期又陡然上升。但总体来说皮肤中EphrinA3的表达与毛发周期是相一致。在0.5天的小鼠背部皮肤中，EphrinA3表达在表皮和毛钉的毛囊的上皮细胞中。在毛囊发育的静止期到生长期的过渡期(20天)，EphrinA3在新发育的次级毛芽中和毛囊的中部表达(例如隆突区)。在第二个生长期，EphrinA3在毛基质细胞中高度表达，而在毛乳头中无表达。EphrinA3的表达量在毛发的生长期初期陡然升高，生长期中期达到高峰，静止期又突然下降，研究还发现EphrinA3蛋白在毛囊发育中呈时空特异性表达，注射EphrinA3的新生小鼠皮肤毛囊的分化进程明显加快，而且毛囊的数量也明显增多。因而，EphrinA3可以加快毛囊的生长和增加毛囊的密度，表明EphA-EphrinA信号通路与毛囊发育紧密相关。现在以蛋白为检测目标的方法通常操作比较繁琐，耗时。半定量反转录PCR需要电泳检测，准确度不够高。

综上所述，现有技术存在的问题是：现在以蛋白为检测目标的方法通常操作比较繁琐，耗时。半定量反转录PCR需要电泳检测，准确度不够高。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于检测细毛羊皮肤毛囊基因表达的特异性引物组合。

本发明是这样实现的，

一种用于检测细毛羊皮肤毛囊基因表达的特异性引物组合，包括绵羊EphrinA3基因的特异性引物和GAPDH基因的特异性引物；所述绵羊EphrinA3基因的特异性引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；所述GAPDH基因的特异性引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

本发明的另一目的在于提供一种用于检测细毛羊皮肤毛囊基因表达的特异性引物组合的构建方法包括：

皮肤组织总RNA的提取及cDNA的合成：利用Trizol法提取皮肤组织总RNA，并经Bioanalyzer 2100检测合格后用于cDNA的合成；cDNA第一链的合成，按照罗氏反转录试剂盒的说明书进行；

实时荧光定量PCR的反应体系：每个样品设置三个重复，以GAPDH为内参基因；采用2-△△Ct法计算相关基因的表达量；

实时荧光定量PCR反应程序。

进一步，2^-△△Ct法计算相关基因的表达量，具体包括：首先△Ct＝目的基因平均Ct值-内参基因平均Ct值；

其次，-△△Ct＝实验组△Ct-对照组△Ct；

最后计算目的基因相对于内参基因的表达量2^-△△Ct。

进一步，所述按照罗氏反转录试剂盒的说明书进行，具体包括：采用罗氏的SYBR@Premix EX Taq TMⅡ(2×)，采用20μL反应体系；荧光定量PCR仪采用Roche Light Cycler 480Ⅱ。

进一步，所述实时荧光定量PCR反应程序，包括：

94℃预变性10min，

94℃变性30s，

60℃退火30s，

72℃延伸40s，运行40个循环。

进一步，所述实时荧光定量PCR反应程序运行结束后进行融解曲线分析，检测引物扩增的特异性。