[发明专利]检测水中铜绿假单胞菌和lasB的引物、试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测水中铜绿假单胞菌及其重要毒力因子弹性蛋白酶LasB基因的双重微滴式数字PCR检测试剂盒，本发明还涉及一种采用上述试剂盒检测食水中铜绿假单胞菌及lasB的方法。

背景技术

铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa原称绿脓杆菌。在自然界分布广泛，为土壤中存在的最常见的细菌之一。各种水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都有本菌存在。本菌存在的重要条件是潮湿的环境。该菌是一种常见的环境微生物，因对营养要求不高，善于利用各种碳源和氨化化合物作为氮源，所以在水、土壤、食品以及医院等环境中广泛存在。美国、加拿大、欧洲、日本、巴西及世界卫生组织对饮用水中铜绿假单胞菌含量的限定MPN<3/L或每250mL不得检出。我国《食品安全国家标准包装饮用水》(GB19298-2014)，则规定5个水样中，每个样中250mL都不得检出铜绿假单胞菌。

2009年10月开始，《饮用天然矿泉水》等水相关的食品安全国 家标准先后都将菌落总数这一指标删除。这一改革虽然具有实际意 义，但客观来说，使得水生产企业简化了消毒程序，大大提高了铜绿 假单胞菌超标概率。近年来，各地更是频现饮用水中铜绿假单胞超标 的情况。

已有研究表明，铜绿假单胞菌的lasB基因可能发挥非常的作用，弹性蛋白酶LasB,由lasB基因编码,全长1497bp，编码498aa，前23aa 为信号肽，24～498aa为前弹性蛋白酶,最终产物为301aa，由Ⅱ型分泌系统分泌至胞外。其生物合成受多个基因如lasA和QS系统的调控等。弹性蛋白酶是铜绿假单胞菌重要的毒力因子,能降解弹性蛋白, 引起肺实质的损伤和出血,与铜绿假单胞菌感染扩散有关；能降解补体和抑制内源性抗菌物质活性。

饮用水生产质量的严格把控需要对铜绿假单胞菌准确、快速检测，同时对铜绿假单胞菌传播风险进行评估。本发明通过设计针铜绿假单胞菌和lasB基因的特异引物、探针组合，可了解水中铜绿假单胞菌的分布和菌株中lasB基因的流行情况。

目前，饮用水相关的很多食品安全标准都要求对铜绿假单胞菌的进行定量检测，但对于铜绿假单胞菌的定量检测主要还是通过传统方法进行培养后计数，但传统方法存在过程繁琐，周期长等缺点。而常规PCR方法需要PCR扩增后进行电泳，不仅操作繁琐，而且不能实现定量检测。目前，Southern blot和实时荧光定量PCR是常用的两种外源基因拷贝数分析技术，已广泛用于外源基因拷贝数分析。但这两种方法也存在一定缺陷。例如，Southern blot方法分析时工作量大、周期长、操作要求高、准确性较差，特别是对于多拷贝基因的分析，结果容易偏小。荧光定量PCR(qRT-PCR)在分析外源基因拷贝数时必须依赖于标准曲线和已知拷贝数的基因，只是一种相对定量方法，且标准曲线的质量易受到DNA纯度、引物和探针的浓度、反应抑制因子等诸多因素影响；另外，标准曲线必须基于标准物质建立，而标准物质的种类有限和昂贵价格不能适用于所有的研究。

微滴数字PCR是近年来兴起的一种新的绝对定量技术，它基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的基因拷贝数。

但基于微滴数字PCR平台的拷贝数的分析工作报道较少，针对铜绿假单胞菌及lasB基因的检测就更未见报道了。本发明基于微滴式 ddPCR平台，建立了铜绿假单胞菌及其lasB基因拷贝数分析方法，研究结果为分析饮用水风险因子的定量检测提供了新的方法和借鉴，也为饮用水日常质量控制提供了一个技术支撑手段。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种引物且组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确，适用于双重ddPCR 检测水中铜绿假单胞菌及lasB基因的试剂盒；

本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测水中铜绿假单胞菌及LasB基因的方法，该方法操作简便、快速，检测结果准确。

为了达到上述目的，本发明采用以下方案：

一种水中铜绿假单胞菌及lasB基因引物，其特征在于该引物的序列和探针序列分别为：

上游引物P.AF:TGGTAGTCCACGCCGTAAA

下游引物P.AR:CAGACTGCGATCCGGACTACG