[发明专利]一种特异性敲减人BRCC3基因慢病毒的构建及在肺癌中的应用

说明书

一种特异性敲减人BRCC3基因的shRNA序列，其包括下述1)和2)中的至少一个双链核苷酸序列：1)正义链具有RNAi‑1‑F的核苷酸序列，反义链具有RNAi‑1‑R的核苷酸序列；2)正义链具有RNAi‑2‑F的核苷酸序列，反义链具有RNAi‑2‑R的核苷酸序列。一种特异性敲减人BRCC3基因的慢病毒的构建方法，其包括如下步骤：Step1,通过PCR合成能特异性敲减人BRCC3基因的shRNA序列；Step2,构建能特异性干扰BRCC3基因的重组质粒；Step3,包装能特异性干扰BRCC3基因的慢病毒；Step4,筛选验证Step3中的能够特异性干扰BRCC3基因的慢病毒；Step5,观察Step3中能够特异性干扰BRCC3基因的慢病毒对肺癌细胞生物学功能的影响。

技术领域

本发明属于分子生物学及肿瘤学领域，具体涉及一种乳腺癌易感基因复合物亚基基因BRCC3及2个稳定敲减BRCC3基因重组质粒的构建及其在肺癌中的应用。

背景技术

恶性肿瘤是严重危害人民生活和健康的重大疾病之一，是全球第二大致死性疾病。其中，肺癌是全球癌性死亡的首要原因，也是导致我国城乡居民死亡的罪魁祸首，其发病率和死亡率仍在不断上升。肺癌起病隐匿，早期不易发现，确诊时多属晚期，手术、化疗、放疗仍是治疗肺癌的主要方法，但是，即使根治性手术也不能避免全身转移，化疗、放疗杀伤作用没有针对性，且长期放化疗会损伤机体的免疫系统及各器官组织的功能，甚至诱发新的癌变。因此，迫切需要找到新的方法和思路来解决这一难题。

随着分子生物学及免疫组学的不断发展，人们把越来越多的目光投到以基因和蛋白为基础的靶向治疗上。靶向治疗是在细胞分子水平上，针对致癌位点(肿瘤细胞内部的蛋白分子、基因片段)，来设计相应的治疗药物，药物进入体内特异地与致癌位点结合，使肿瘤细胞死亡，而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞，所以分子靶向治疗又被称为生物导弹。由此可知，在分子靶向治疗中，寻找合适的治疗靶点至关重要。

BRCC3是乳腺癌易感基因复合物亚基3，是2003年从BRCC复合物中发现的一种含锌JAMM/MPN+类去泛素化酶，由316个氨基酸组成，分子量约为36kDa。既往对BRCC3的研究主要集中于其在正常生理过程中的作用，如调控细胞周期检查点、DNA损伤修复、细胞有丝分裂等多种细胞活动，在血管生成、心肌缺血再灌注、心肌凋亡等过程中发挥重要作用。近年来，有研究发现，BRCC3在乳腺癌、鼻咽癌中高表达，可作为预后标志物，促进肿瘤细胞增殖，参与放疗耐受和化疗耐药，可作为肿瘤生物治疗潜在靶点，但其具体机制及在肺癌中的作用仍未阐明。

发明内容

本发明的目的在于针对BRCC3基因在肿瘤中的研究现状及其可作为潜在治疗靶点的应用前景，提供一种能特异性敲减BRCC3基因的shRNA序列及慢病毒的制备方法，并进一步验证该慢病毒对肺癌细胞的作用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

Step1,通过PCR合成能特异性敲减人BRCC3基因的shRNA序列；

Step2,构建能特异性干扰BRCC3基因的重组质粒；

Step3,包装能特异性干扰BRCC3基因的慢病毒；

Step4,筛选验证Step3中的能够特异性干扰BRCC3基因的慢病毒；

Step5,观察Step3中能够特异性干扰BRCC3基因的慢病毒对肺癌细胞生物学功能的影响。

进一步的，步骤Step1中，包含如下步骤：

(1):利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)数据库，获得人BRCC3基因的转录本及编码(CDS)区信息。

(2):针对人BRCC3基因的编码区，设计2个能特异性敲减人BRCC3基因的核苷酸序列。