[发明专利]一种尖吻蝮蛇凝血酶重组蛋白的表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种尖吻蝮蛇凝血酶重组蛋白的表达方法。

背景技术

尖吻蝮蛇凝血酶(Haemocoagulase Acutus，简写为Halase)是本团队研发的一类止血新药，是一种从尖吻蝮蛇(Agkistrodonacutus)蛇毒中分离纯化的类凝血酶，具有较强的止血作用，且安全无毒。

目前，毒蛇的来源主要为人工饲养和野外捕捉两种方式，各异的地理环境和饲养条件等因素，使得蛇毒的成分和性质都存在着很大的差异，为规模化生产造成一定的难度，产品的均一性受到限制。随着生物工程技术的发展，开发蛇毒类凝血酶(Snake Venom Thrombin-Like Enzymes,SVTLEs)重组蛋白产品替代这类天然产物成为了SVTLEs药物研发的一个重要方向，以期通过蛋白质工程的手段，稳定表达具有良好生理活性的SVTLEs产品。

对于SVTLEs重组蛋白表达体系的构建，最早是通过原核表达系统进行的。虽然SVTLEs的糖基化修饰情况不尽相同，但是大部分SVTLEs都是糖蛋白，含量在0％-30％间，个别种类甚至高达40％以上。而常用的细菌表达株并不具备糖基化的能力，这将大大影响到蛋白的活性。而且大肠杆菌的表达多以包涵体形式存在，研究人员通常需要添加硫氧还原蛋白(thioredoxin,TrxR)标签来增加外源蛋白的可溶性表达。真核表达系统中，较为成熟的酵母表达体系也被用作SVTLEs的重组蛋白表达。然而酵母表达体系对于外源蛋白的表达可能存在过度的糖基化修饰，或者缺乏复杂性糖链的修饰，这些也会影响重组蛋白的功能。

哺乳动物细胞表达体系因具有更高级的糖基化机制，逐渐成为了异源糖蛋白表达的重要体系。在哺乳动物细胞表达体系中，CHO细胞已经成为了生物制药领域最重要的表达系统，无血清悬浮培养技术的发展极大改善了传统哺乳动物细胞表达系统易受病毒感染、自动化水平低的局限性，更加适合工业化大规模生产。所以其应用得到不断拓展，被广泛应用于抗体、疫苗、重组蛋白药物等生物医药制品的研发。美国食品药品监督管理局在2010年批准了CHO表达蛋白直接入药。

发明内容

为解决上述技术问题：本申请提出一种尖吻蝮蛇凝血酶重组蛋白的表达方法，首次利用CHO细胞通过无血清悬浮培养技术表达一种尖吻蝮蛇凝血酶重组蛋白，包括如下步骤：

(1)优化尖吻蝮蛇凝血酶基因；

(2)PCR扩增优化的尖吻蝮蛇凝血酶基因；

(3)构建表达载体；

(4)将重组质粒转染至CHO细胞；

(5)重组蛋白表达鉴定。

其中，步骤(3)表达载体的构建方法具体为：将回收的PCR产物与pMCX克隆载体酶切连接，构建Agkis-pMCX质粒，将Agkis-pMCX质粒转化大肠杆菌感受态细胞中扩增，经Amp抗性筛选出阳性克隆，进行测序；提取测序正确的重组质粒。

所述PCR产物与pMCX克隆载体酶切连接方法优选方法为：对扩增后的尖吻蝮蛇凝血酶基因进行内切酶消化，使用T4连接酶把基因目的片段连接到表达载体上。

步骤(4)将重组质粒转染至CHO细胞的具体方法为：取细胞适量离心,用新鲜溶液重悬，使细胞终密度为5mioc/mL；离心时，将质粒DNA与PEI预混，室温孵育；处理好的DNA&PEI混合物，加入到准备的细胞中，混匀，31℃培养；转染，加入适量的DMSO，摇晃混匀，31℃培养；转染后取样品进行检测；其中包含蛋白质基因全长的重组质粒单独转染，含A亚基基因序列和B亚基基因序列的重组质粒共转染至CHO细胞。

所述步骤(1)的具体方法包括以下步骤：

1)根据哺乳动物的编码偏好对尖吻蝮蛇凝血酶基因序列进行优化；

2)根据合成的尖吻蝮蛇凝血酶基因设计上游引物和下游引物，引物中引入了NotⅠ和BamHⅠ两个酶切位点，另外还添加了一段分泌性信号肽序列；

3)该基因包含了蛋白质的A亚基和B亚基两个亚基序列，通过对上下游引物的调整，可分别扩增出蛋白质基因序列全长、A亚基基因序列和B亚基基因序列。

相对于现有技术，本发明是首次利用无血清悬浮式培养的CHO细胞表达一种重组尖吻蝮蛇凝血酶，运用生物工程手段，较成功地解决了蛇毒产品原料来源不足、质量不稳定的实际生产问题。

附图说明

图1为本发明实施例优化重组尖吻蝮蛇凝血酶基因序列的示意图。

图2为本发明实施例重组尖吻蝮蛇凝血酶SDS-PAGE电泳示意图。