[发明专利]一种尖吻蝮蛇凝血酶重组蛋白的表达方法

权利要求书

1.一种尖吻蝮蛇凝血酶重组蛋白的表达方法，依次包括尖吻蝮蛇凝血酶基因优化、优化基因PCR扩增、表达载体构建、重组质粒转染及重组蛋白表达鉴定步骤，其特征在于：所述的表达载体构建方法为将回收的PCR产物与pMCX克隆载体酶切连接，构建Agkis-pMCX质粒，将Agkis-pMCX质粒转化大肠杆菌感受态细胞中扩增，经Amp抗性筛选出阳性克隆，进行测序；提取测序正确的重组质粒；所述的重组质粒转染方法为将重组质粒转染至CHO细胞，其中包含蛋白质基因全长的重组质粒单独转染，含A亚基基因序列和B亚基基因序列的重组质粒共转染至CHO细胞。

2.如权利要求1所述的表达方法，其特征在于：所述的重组质粒转染方法具体为：取细胞适量离心,用新鲜溶液重悬，使细胞终密度为5mioc/mL；离心时，将质粒DNA与PEI预混,室温孵育3-5min；处理好的DNA&PEI混合物，加到准备的细胞中，混匀，31℃培养；转染后10min，加入适量的DMSO，摇晃混匀，31℃培养；转染后取样品进行检测；其中包含蛋白质基因全长的重组质粒单独转染，含A亚基基因序列和B亚基基因序列的重组质粒共转染至CHO细胞。

3.如权利要求1或2所述的表达方法，其特征在于：所述的表达载体构建方法中将回收的PCR产物与pMCX克隆载体酶切连接的具体方法为：对PCR产物进行内切酶消化，使用T4连接酶把基因目的片段连接到表达载体上。

4.如权利要求1所述的表达方法，其特征在于：所述的尖吻蝮蛇凝血酶基因优化方法包括以下步骤：

(1)根据哺乳动物的编码偏好对尖吻蝮蛇凝血酶基因序列进行优化；

(2)根据合成的尖吻蝮蛇凝血酶基因设计上游引物和下游引物，引物中引入了NotⅠ和BamHⅠ两个酶切位点，另外还添加了一段分泌性信号肽序列；

(3)该基因包含了蛋白质的A亚基和B亚基两个亚基序列，通过对上下游引物的调整，可分别扩增出蛋白质基因序列全长、A亚基基因序列和B亚基基因序列。

5.如权利要求1所述的表达方法，其特征在于：所述重组蛋白表达鉴定方法包括以下步骤：

(1)SDS-PAGE：电泳第一块胶：事先配置的12％浓度的聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样15μl，用80V电压跑至样品出浓缩胶后将电压调为120V后电泳约90min；第二块胶：事先配置的12％浓度的聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样15μl，用80V电压跑至样品出浓缩胶后将电压调为120V后电泳约90min；

(2)Western blot：80mA转膜40min，加入5％脱脂奶粉室温封闭1h；特异性抗体按照1：5000的比例室温孵育2h；TBST洗涤3次，每次5min；兔源抗IgG抗体室温孵育1h；PBST洗涤3次，每次5min；ECL显色，曝光1min拍照。