[发明专利]一种催化合成肌肽的氨肽酶及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种合成肌肽的方法，尤其是采用高效的氨肽酶催化和现代化的分离技术的肌肽合成方法，具体是一种催化合成肌肽的氨肽酶及其制备方法。

背景技术

L-肌肽1900年首次在牛肉中发现，在哺乳动物的大脑、肌肉和其他组织中广泛存在，其结构主要由β-丙氨酸和L-组氨酸两部分组成，是一种天然的活性二肽，在水、0.1mol/L盐酸和0.1mol/L氢氧化钠中易溶，在甲醇、乙腈、无水乙醇、三氯甲烷和丙酮中几乎不溶。研究证明L-肌肽有抗氧化作用，有抗衰老功能，对高血压、心脏病、老年性白内障、溃疡等都有治疗效果，还有抗肿瘤等生物活性，可延缓皮肤衰老。与其他抗氧化剂相比，L-肌肽具有抗氧化能力强、无毒副作用的优点，并有多种生理活性，在医药、保健、卫生、美容等领域有广泛的应用前景。目前，L-肌肽新的生理活性与机制的探索仍是热点。文献报道的L-肌肽的化学合成方法较多，主要有两大类：（1）有β-丙氨酸参与的反应。大致的方法是β-丙氨酸经氨基保护、羧基活化后与保护的L-组氨酸反应，然后脱掉保护基团得到产品肌肽。（2）无β-丙氨酸直接参与的反应。大致方法为L-组氨酸先与不同的β-丙氨酸前体反应生成肽键，再经进一步反应转换为肌肽。在本发明中使用氨肽酶催化L-组氨酸与β-丙氨酸合成肌肽，制酶成本低，合成时间短、转化率高、环境友好，工艺操作简单、安全等，具有大规模工业应用的广泛前景。

发明内容

为了解决以上问题，本发明的第一个目的在于提供一种催化合成肌肽的氨肽酶。

本发明的第二个目的是提供一种编码所述催化合成肌肽的氨肽酶的核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供一种催化合成肌肽的氨肽酶的制备方法。

本发明提供肌肽的氨肽合成采用氨肽酶法催化一步合成肌肽；

本发明采用酶高效催化组氨酸和β丙氨酸生成肌肽，并采用现代化的先进分离技术，使肌肽的工业化生产成本大大降低。

本发明的技术方案如下：

一种催化肌肽生物合成的氨肽酶，所述氨肽酶为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

根据本发明所述催化肌肽生物合成的氨肽酶，所述氨肽酶来源于体外重组构建的基因工程菌株。

根据本发明所述催化肌肽的生物合成的氨肽酶，所述基因工程菌株为大肠杆菌、毕氏酵母、枯草芽孢杆菌。

本发明还提供一种编码所述的氨肽酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供一种所述的氨肽酶基因工程菌的制备方法，包括如下步骤：

（1）首先构建氨肽酶的基因工程菌株，将上述SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列经酶切重组到表达载体，转化到宿主细胞中；

（2）取原种菌种在YPD平板上划线，30℃，倒置培养40h；

（3）在平板上挑取单菌落转移至液体培养基中，30℃，振荡培养24小时，OD600增长至4～5；

（4）以10%的接种量接种至液体培养基的摇瓶中，30℃，200rpm振荡培养，约24小时后OD600生长至12左右；

（5）将发酵培养基配制好后，转移至发酵罐中，121℃灭菌30min；降温至30±2℃，使用氨水调节pH值至5.0；

（6）将培养好的菌种液接种至发酵罐，接种量5%；

（7）根据溶氧调节转速和通气，保持溶氧在30%以上，诱导发酵96小时后，放罐；

（8）离心，收集清液；

（9）将清液超滤浓缩后冻干，得到合成肌肽用氨肽酶的冻干粉。

采用上述的氨肽酶催化合成肌肽的方法，包括如下步骤：

1）β-丙氨酸甲酯盐酸盐合成：

1.1）向反应釜中加入甲醇，控温0～20℃将氯化亚砜滴入其中，滴加完毕，加入β-丙氨酸，30～60℃保温搅拌；

1.2）30～50℃减压，真空度≤-0.09MPa，浓缩，浓缩至无馏分流出，得β-丙氨酸甲酯盐酸盐；

2）酶催化反应：

2.1 向反应釜中加入L-组氨酸、去离子水、上述反应制备的β-丙氨酸甲酯盐酸盐；

2.2 在15～45℃温度下，用碱性溶液调节pH值至7.0～9.0；

2.3 加入如权利要求4所述制备的氨肽酶，该氨肽酶的用量为反应液体积的1%～3%，25～45℃搅拌反应，反应过程中用碱性溶液控制反应体系pH值在7.0～9.0；

3）肌肽粗品制备：

3.1 反应完毕，放料，料液离心除去不溶物，收集滤液；