[发明专利]一种催化合成肌肽的氨肽酶及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种催化合成肌肽的氨肽酶，所述氨肽酶为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述催化合成肌肽的氨肽酶，其特征在于，所示氨肽酶来源于体外重组构建的基因工程菌株；所述基因工程菌株为大肠杆菌、毕氏酵母、枯草芽孢杆菌。

3.一种编码权利要求1所述的氨肽酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

4.一种权利要求1所述的氨肽酶的制备方法，包括如下步骤：

1）首先构建氨肽酶的基因工程菌株，将权利要求3所述的核苷酸序列经酶切重组到表达载体，转化到宿主细胞中；

2）取原种菌种在YPD平板上划线，30℃，倒置培养40h；

3）在平板上挑取单菌落转移至液体培养基中，30℃，振荡培养24小时，OD600增长至4～5；

4）以10%的接种量接种至液体培养基的摇瓶中，30℃，200rpm振荡培养，约24小时后OD600生长至12左右；

5）将发酵培养基配制好后，转移至发酵罐中，121℃灭菌30min；降温至30±2℃，使用氨水调节pH值至5.0；

6）将培养好的菌种液接种至发酵罐，接种量5%；

7）根据溶氧调节转速和通气，保持溶氧在30%以上，诱导发酵96小时后，放罐；

8）离心，收集清液；

9）将清液超滤浓缩后冻干，得到合成肌肽用氨肽酶的冻干粉。

5.采用权利要求1所述的氨肽酶催化合成肌肽的方法，包括如下步骤：

1）β-丙氨酸甲酯盐酸盐合成

1.1）向反应釜中加入甲醇，控温0～20℃将氯化亚砜滴入其中，滴加完毕，加入β-丙氨酸，30～60℃保温搅拌；

1.2）30～50℃减压，真空度≤-0.09MPa，浓缩，浓缩至无馏分流出，得β-丙氨酸甲酯盐酸盐；

2）酶催化反应

2.1 向反应釜中加入L-组氨酸、去离子水、上述反应制备的β-丙氨酸甲酯盐酸盐；

2.2 在15～45℃温度下，用碱性溶液调节pH值至7.0～9.0；

2.3 加入如权利要求4所述制备的氨肽酶，该氨肽酶的用量为反应液体积的1%～3%，25～45℃搅拌反应，反应过程中用碱性溶液控制反应体系pH值在7.0～9.0；

3）肌肽粗品制备

3.1 反应完毕，放料，料液离心除去不溶物，收集滤液；

3.2 将得到的滤液通过超滤机进行超滤，收集超滤透析液；

3.3 将得到的超滤透析液通过纳滤机进行纳滤，收集纳滤浓缩液；

3.4 将纳滤浓缩液上离子树脂柱，树脂柱的径高比为0.05～0.2，上样pH值为5.0～7.0；

3.5 用纯化水冲洗树脂柱；

3.6 用1%～5%的氨水洗脱解吸附树脂柱，收集茚三酮显色部分洗脱液；

3.7 将收集的洗脱液50～80℃减压，真空度≤-0.09MPa，浓缩肌肽含量至20～40%；

3.8 加入析晶溶剂，0～25℃，搅拌析晶10～24h；

3.9 析晶完毕，放料离心，30～50℃，减压，真空度≤-0.09MPa，干燥6～8h，得肌肽粗品。

6.根据权利要求5所述的氨肽酶催化合成肌肽的方法，其特征在于：所述的析晶溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇或丙酮中的一种。

7.根据权利要求5所述的氨肽酶催化合成肌肽的方法，其特征在于：所述的超滤机的滤膜孔径为8000～10000道尔顿。

8.根据权利要求5所述的氨肽酶催化合成肌肽的方法，其特征在于：所述的纳滤机的滤膜孔径为200～300道尔顿。