[发明专利]一种定量高通量测序文库的制备方法及其配套试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种精确定量制备高通量测序文库的方法及其配套试剂盒。

背景技术

随着高通量测序技术的普及，针对各种不同来源样品的高通量测序文库制备方法及商业试剂盒也得到大量应用。市场上主流的高通量文库制备试剂盒诸如Illumina公司的Truseq系列DNA/RNA文库制备试剂盒，KAPA公司的Hyper系列建库试剂盒，NEB公司用于二代测序的NEBNext DNA/RNA文库制备试剂等，这些种类繁多、功能各异的试剂盒能应对不同测序平台、不同样本来源等各种需求，最大程度地满足科研和临床等实际应用。不过，目前还没有一种完全定量化的文库制备方法，无法满足精准医学和定量生物学的实际需要。

因此，本领域尚缺乏一种专门针对精确定量需求的高通量测序文库制备方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种精确定量化的针对DNA样品的高通量测序文库制备方法。

本发明的第一方面提供了一种衔接子，所述衔接子具有式I或II所示的结构：

5'-S1─S2─S3─S4─S5─S6-3' (I)

5'-pS1─S2─S3─S4─S5─S6-3' (II)

各式中，

S1为任选地引导部(N)_m，N为A、T、G、C中任一碱基，m为1-150的正整数；

pS1为磷酸化的S1；

S2为茎部1，具有SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列；

S3为环部，其中含有至少一个碱基U；

S4为茎部2，具有SEQ ID NO.:2所示的核苷酸序列；

S2与S4完全互补或部分互补；

S5为无或与引导部S1互补的延伸部；

S6为无或含有至少一个碱基T的结合部；

若S5为无，则S6为无；

“─”为化学键。

在另一优选例中，所述的衔接子为线性结构、或茎环结构。

在另一优选例中，所述的衔接子具有式III或IV所示结构：

在另一优选例中，m为1-100，更佳地1-50，最佳地5-20的任一正整数。

在另一优选例中，m为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。

在另一优选例中，所述环部S3具有SEQ ID NO.:3所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述S6含有1个碱基T。

在另一优选例中，所述衔接子的S2具有SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列；S3具有SEQ ID NO.:3所示的核苷酸序列；S4具有SEQ ID NO.:2所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，S2与S4是完全互补的，或除了未互补的1或2个碱基之外均为是互补的。

本发明的第二方面提供了一种基于核酸样品构建测序文库的方法，包括步骤：

(a)提供一用于构建测序文库的核酸样品；

(b)对所述的核酸样品进行末端修复反应，获得末端经修复的核酸样品；

(c)对所述的末端经修复的核酸样品进行3'末端加dA尾反应，获得经加尾的核酸样品；

(d)将所述经加尾的核酸样品与权利要求1-5中任一所述的衔接子混合，并进行连接反应，从而形成含“衔接子-核酸-衔接子”复合物的第一混合物；

(e)将步骤(d)中获得的“衔接子-核酸-衔接子”复合物与USER酶混合，使得衔接子中的U被降解，形成含末端分叉不互补的“衔接子-核酸-衔接子”复合物的第二混合物；

(f)将步骤(e)中获得的含所述复合物的第二混合物与片段分选磁珠混合，使得所述片段分选磁珠吸附多余的衔接子，并将所述被吸附的衔接子去除，获得第三混合物；

(g)以步骤(f)获得的所述复合物为模板，用特异性结合于衔接子的第一引物和特异性结合于衔接子的第二引物进行PCR反应，获得扩增产物；

(h)以将步骤(g)中获得的扩增产物为原料，制得测序文库。

在另一优选例中，在步骤(h)中，还包括对所述扩增产物进行纯化的步骤。

在另一优选例中，所述的纯化包括用片段分选磁珠去除多余的引物。

在另一优选例中，所述步骤(c)和(d)之间还包括步骤：