[发明专利]一种定量高通量测序文库的制备方法及其配套试剂盒

权利要求书

1.一种衔接子，其特征在于，所述衔接子具有式I或II所示的结构：

5'-S1─S2─S3─S4─S5─S6-3'(I)

5'-pS1─S2─S3─S4─S5─S6-3' (II)

各式中，

S1为任选地引导部(N)_m，N为A、T、G、C中任一碱基，m为1-150的正整数；

pS1为磷酸化的S1；

S2为茎部1，具有SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列；

S3为环部，其中含有至少一个碱基U；

S4为茎部2，具有SEQ ID NO.:2所示的核苷酸序列；

S2与S4完全互补或部分互补；

S5为无或与引导部S1互补的延伸部；

S6为无或含有至少一个碱基T的结合部；

若S5为无，则S6为无；

“─”为化学键。

2.如权利要求1所述的衔接子，其特征在于，m为1-100，更佳地1-50，最佳地5-20的任一正整数。

3.如权利要求1所述的衔接子，其特征在于，所述环部S3具有SEQ ID NO.:3所示的核苷酸序列。

4.如权利要求1所述的衔接子，其特征在于，所述S6含有1个碱基T。

5.如权利要求1所述的衔接子，其特征在于，所述衔接子的S2具有SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列；S3具有SEQ ID NO.:3所示的核苷酸序列；S4具有SEQ ID NO.:2所示的核苷酸序列。

6.一种基于核酸样品构建测序文库的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)提供一用于构建测序文库的核酸样品；

(b)对所述的核酸样品进行末端修复反应，获得末端经修复的核酸样品；

(c)对所述的末端经修复的核酸样品进行3'末端加dA尾反应，获得经加尾的核酸样品；

(d)将所述经加尾的核酸样品与权利要求1-5中任一所述的衔接子混合，并进行连接反应，从而形成含“衔接子-核酸-衔接子”复合物的第一混合物；

(e)将步骤(d)中获得的“衔接子-核酸-衔接子”复合物与USER酶混合，使得衔接子中的U被降解，形成含末端分叉不互补的“衔接子-核酸-衔接子”复合物的第二混合物；

(f)将步骤(e)中获得的含所述复合物的第二混合物与片段分选磁珠混合，使得所述片段分选磁珠吸附多余的衔接子，并将所述被吸附的衔接子去除，获得第三混合物；

(g)以步骤(f)获得的所述复合物为模板，用特异性结合于衔接子的第一引物和特异性结合于衔接子的第二引物进行PCR反应，获得扩增产物；

(h)以将步骤(g)中获得的扩增产物为原料，制得测序文库。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中核酸样品总量为500pg～1μg。

8.一种基于核酸样品构建测序文库的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

一末端修复/加dA尾复合酶及其缓冲液；

一T4DNA连接酶；

一衔接子，所述的衔接子如权利要求1-5中任一所述；

和说明书，所述的说明书记载了使用方法。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：特异性结合于衔接子的第一引物和第二引物。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述第二引物带有测序标记。