[发明专利]一种评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断ELISA试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及兽用诊断制品，具体涉及一种评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断ELISA试剂盒及其应用。

背景技术

兔出血症病毒(Rabbit Hemorrhagic Disease Virus，RHDV)是兔病毒性出血症(Rabbit Hemorrhagic Disease，RHD)又称兔瘟的病原，是一种严重威胁家兔产业发展的高传播性、高致死性病毒，病程一般为48-72小时。该病于1984年首先在中国报道，随后迅速在全球大部分地区流行，造成数以亿计的家兔和野兔死亡，给全球的兔产业和生态造成巨大损失和破坏。1989年,世界动物卫生组织(OIE)将该病正式列为B类传染病，我国将其列为二类传染病。

目前，对兔病毒性出血症灭活疫苗效力评价方法为经典的血凝抑制试验(Hemagglutination inhibition test，HI)，所用到的血为人的“O”型红细胞，由于“O”型红细胞难以获得，使得试验难以开展，HI难以应用于大量样本的检测，此外，通过HI试验筛选和测定抗体，血清样品需要进行白陶土等的处理，对血凝价的判定，4单位HA的标定，试验用PBS液pH控制等，整个试验过程对操作者的要求相对较高，试验的周期较长，结果的人为因素影响较大、灵敏度较低。

发明内容

本发的目的是提供一种评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断ELISA试剂盒，该试剂盒原料易得、操作简单、耗时短、灵敏度较高、结果准确、直观容易判断。

本发明还提供采用上述试剂盒评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断ELISA方法。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断ELISA试剂盒，包括：检测板、VP60VLPs溶液、抗兔出血症病毒单克隆抗体1B8和HRP标记的羊抗鼠IgG抗体；

所述检测板是采用H(type-2)-PAA-biotin包被的96孔高结合力亲和素化酶标反应板；

所述VP60VLPs是兔出血症病毒VP60蛋白形成的病毒样颗粒；

在本发明中，所述VP60VLPs溶液采用如下方法制备：将重组杆状病毒rAcV-Bac-VP60采用Sf9细胞进行培养，然后采用蔗糖密度梯度离心法纯化获得。

优选的技术方案中，H(type-2)-PAA-biotin的包被浓度为1.5-3.5μg/mL；所述VP60VLPs溶液的浓度为1-3μg/mL

优选的技术方案中，所述96孔高结合力亲和素化酶标反应板在包被后采用4-6％脱脂乳溶液封闭后得到所述检测板。

在本发明中，所述试剂盒还包括样品稀释液、洗涤液、终止液、标准阳性血清、标准阴性血清和显色液；

所述样品稀释液为PBS缓冲液；

所述洗涤液是含有0.05％吐温-20的PBS缓冲液；

所述终止液为2M的硫酸水溶液；

标准阳性血清：采用兔病毒性出血症疫苗免疫SPF兔，取HI效价＞2⁶的兔血清，作为标准阳性血清；

标准阴性血清：SPF兔血清。

优选的技术方案中，所述VP60VLPs溶液浓度为1-3μg/mL。

本发明还提供采用所述试剂盒评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断ELISA方法，包括如下步骤：

1)将100μL待检血清、标准阳性血清、标准阴性血清分别与100μL浓度为2μg/mL的VP60VLPs溶液混合，37℃孵育1.5h，得到待检血清、标准阳性血清、标准阴性血清的预处理液；

2)在检测板的待检血清孔、阳性对照孔、阴性对照孔中分别加入100μL待检血清、标准阳性血清、标准阴性血清的预处理液，37℃孵育1.5h，采用洗涤液洗涤；

3)将单克隆抗体1B8，加入酶标板中，100μL/孔，37℃孵育1h，采用洗涤液洗涤；

4)加HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，100μL/孔，37℃孵育1h，采用洗涤液洗涤；

5)加显色液，100μL/孔，避光反应10min进行显色；

6)每孔加入50μL终止液；

7)采用酶标仪检测各孔在450nm波长处的吸光值OD_450nm，按照如下公式计算阻断率PI：

阻断率PI＝(阴性对照孔OD_450nm-待检血清孔OD_450nm)/阴性对照孔OD_450nm×100％；