[发明专利]一种评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断ELISA试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断ELISA试剂盒，包括：检测板、VP60 VLPs溶液、抗兔出血症病毒单克隆抗体1B8和HRP标记的羊抗鼠IgG抗体；

所述检测板是采用H（type-2）-PAA-biotin包被的96孔高结合力亲和素化酶标反应板；

所述VP60 VLPs是兔出血症病毒VP60蛋白形成的病毒样颗粒。

2.根据权利要求1所述评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断ELISA试剂盒，其特征在于所述VP60 VLPs溶液采用如下方法制备：将重组杆状病毒rAcV-Bac-VP60采用Sf9细胞进行培养，然后采用蔗糖密度梯度离心法纯化获得。

3.根据权利要求1或2所述评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断ELISA试剂盒，其特征在于H（type-2）-PAA-biotin的包被浓度为1.5-3.5μg/mL；所述VP60 VLPs溶液的浓度为1-3μg/mL。

4.根据权利要求3所述评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断ELISA试剂盒，其特征在于所述96孔高结合力亲和素化酶标反应板在包被后采用4-6%脱脂乳溶液封闭后得到所述检测板。

5.根据权利要求4所述评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断ELISA试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括样品稀释液、洗涤液、终止液、标准阳性血清、标准阴性血清和显色液；

所述样品稀释液为PBS缓冲液；

所述洗涤液是含有0.05%吐温-20的PBS缓冲液；

所述终止液为2M的硫酸水溶液；

标准阳性血清：采用兔病毒性出血症疫苗免疫SPF兔，取HI效价＞2⁶的兔血清，作为标准阳性血清；

标准阴性血清：SPF兔血清。

6.采用权利要求1所述试剂盒评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断ELISA方法，包括如下步骤：

1）将100μL待检血清、标准阳性血清、标准阴性血清分别与100μL浓度为2 μg/mL的VP60 VLPs溶液混合，37℃孵育1.5 h，得到待检血清、标准阳性血清、标准阴性血清的预处理液；

2）在检测板的待检血清孔、阳性对照孔、阴性对照孔中分别加入100 μL待检血清、标准阳性血清、标准阴性血清的预处理液，37℃孵育1.5 h，采用洗涤液洗涤；

3）将单克隆抗体1B8，加入酶标板中，100 μL /孔，37℃孵育1 h，采用洗涤液洗涤；

4）加HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，100 μL /孔，37℃孵育1 h，采用洗涤液洗涤（PBST洗涤5次，每次5 min）；

5）加显色液，100 μL /孔，避光反应10min进行显色；

6）每孔加入50 μL终止液；

7）采用酶标仪检测各孔在450 nm波长处的吸光值OD_450nm，按照如下公式计算阻断率PI：

阻断率PI=(阴性对照孔OD_450nm-待检血清孔OD_450nm) /阴性对照孔OD_450nm100%；

判定标准如下：当阻断率PI≥30.99%时判定为血清阳性反应，兔病毒性出血症疫苗免疫后可以保护病毒攻击；当PI≤25.3%时，判定为血清抗体阴性反应，兔病毒性出血症疫苗免疫后不能保护病毒的攻击；当25.3%＜PI＜30.99%时判定为可疑，重复检测一次，如果PI仍然低于30.99%则判定为血清抗体阴性，兔病毒性出血症疫苗免疫后不能保护病毒的攻击。