[发明专利]高粱花叶病毒间接ELISA检测方法及其试剂盒与应用

说明书

本发明公开了一种甘蔗中的高粱花叶病毒间接ELISA检测试剂盒，主要包括特异性识别高粱花叶病毒的兔抗多克隆抗体和辣根过氧化酶标记的羊抗兔lgG标准液。其中，多克隆抗体以甘蔗高粱花叶病毒的P3蛋白N端保守区多肽为抗原制备。据此，发明人还建立了相应的间接ELISA检测方法，并将之用于甘蔗中的高粱花叶病毒检测。与现有技术相比，本发明具有灵敏度高、特异性强、成本低、高通量、检测快速的优点，既适用于田间对少量样品的快速检测，也适用于实验室内的大量样品的高通量快速检测。

技术领域

本发明属于高粱花叶病毒检测领域，尤其涉及一种高粱花叶病毒间接ELISA检测方法及其试剂盒与应用。

背景技术

甘蔗是世界上最重要的糖料作物，也是最具潜力的可再生能源作物。甘蔗生长过程中会受到病毒的危害，且经过长期无性繁殖，多种病毒会积累在不同甘蔗品种及种质材料中，导致其种性退化，产量和品质下降，给甘蔗产业带来严重损失。

甘蔗花叶病是甘蔗主要病害之一，其主要病原是马铃薯Y病毒属甘蔗花叶病毒亚组的甘蔗高粱花叶病毒(SrMV)，该病毒可经蚜虫叮咬和机械损伤进行近距离传播，其自然寄主为禾本科的高粱和甘蔗等。甘蔗主要通过种茎进行无性繁殖，会造成该病毒的积累和远距离传播。被感染植株的叶面会出现黄绿相间不规则的嵌纹、条斑或斑驳，叶色褪绿等症状，病状在幼嫩叶片的基部较明显，影响光合作用的效率，会造成甘蔗产量和含糖量下降。因此，建立一种操作简单、特异灵敏、成本低廉的SrMV高效检测方法，对田间病毒调查，防止该病毒传播，以及建立无毒甘蔗种苗体系等具有重要意义。

目前检测病毒常用的方法可分为分子检测技术和血清学检测技术两类。分子检测技术是一种基于核酸水平的检测，具有准确高效、灵敏快速的特点，但操作比较复杂，成本很高。常见的SrMV检测方法为PCR检测技术，首先需要对甘蔗提取总RNA，反转录为cDNA，再进行PCR扩增，最后进行电泳分析，甚至还要进行基因组序列测定。PCR技术操作过程繁琐、耗时长，并且该技术完全依赖于PCR仪器和商业化的试剂，所以实验成本较高，不利于田间病毒病的大规模检测。此外，PCR技术假阳性较高，整个过程需要专业人员操作，难以普及推广。

酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种免疫学检测方法，具有灵敏度高、操作方便且经济实用的特点，其极大地克服了RT-PCR存在的缺点，不需要提取核酸，也不容易交叉污染，适合于田间或出入境口岸大规模样品检测，因而越来越受到人们的青睐和重视。目前ELISA技术在甘蔗病毒检测方面还不成熟，还难以应用于田间病害调查以及健康甘蔗种苗选育。目前，国内还没有商业化检测甘蔗病毒的ELISA试剂盒，这既是一研究热点，也是一研发目标，其技术的关键在于制备高质量的检测抗体。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、特异性强、成本低、高通量、检测快速的高粱花叶病毒间接ELISA检测方法及其试剂盒与应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：高粱花叶病毒间接ELISA检测试剂盒，主要包括特异性识别高粱花叶病毒的兔抗多克隆抗体和辣根过氧化酶标记的羊抗兔lgG标准液。

多克隆抗体以甘蔗高粱花叶病毒的P3蛋白N端保守区多肽为抗原制备。

制备按以下操作进行：从NCBI网站获得SrMV的P3基因序列，预测P3蛋白的氨基酸序列，选取N端暴露于天然蛋白外表的多肽为抗原，合成该多肽，将此多肽与弗氏佐剂混合免疫兔子，采集兔子血液，经亲和层析纯化获得多克隆抗体。

多肽具有序列表SEQ.ID.No.1的氨基酸序列。

高粱花叶病毒间接ELISA检测方法，以兔抗的甘蔗高粱花叶病毒P3蛋白N端保守区制备的多克隆抗体作为一抗，辣根过氧化酶标记的羊抗兔lgG标准液作为二抗对甘蔗中的高粱花叶病毒进行ELISA检测。

上述高粱花叶病毒间接ELISA检测方法，按以下步骤进行操作：