[发明专利]高粱花叶病毒间接ELISA检测方法及其试剂盒与应用

权利要求书

1.一种高粱花叶病毒间接ELISA检测试剂盒，其特征在于包括特异性识别高粱花叶病毒的兔抗多克隆抗体和辣根过氧化酶标记的羊抗兔lgG标准液；所述多克隆抗体以甘蔗高粱花叶病毒的P3蛋白N端保守区多肽为抗原制备；所述制备按以下操作进行：从NCBI网站获得SrMV的P3基因序列，预测P3蛋白的氨基酸序列，选取N端暴露于天然蛋白外表的多肽为抗原，合成该多肽，将此多肽与弗氏佐剂混合免疫兔子，采集兔子血液，经亲和层析纯化获得多克隆抗体；所述多肽为序列表SEQ.ID.No.1的氨基酸序列。

2.使用权利要求1所述试剂盒的高粱花叶病毒间接ELISA检测方法，其特征在于以所述兔抗多克隆抗体作为一抗，辣根过氧化酶标记的羊抗兔lgG标准液作为二抗对甘蔗中的高粱花叶病毒进行ELISA检测。

3.根据权利要求2所述的高粱花叶病毒间接ELISA检测方法，其特征在于按以下步骤进行操作：

A.样品处理：称取待检甘蔗样品，将其制成匀浆，离心或静置沉淀，取上清液用包被缓冲液稀释2-8倍备用；

B.样品包被：取100μL经适当稀释的检测样品液加入96孔酶标板中，以SrMV抗原标准液为阳性对照，以健康甘蔗样品液为阴性对照，在37℃条件下包被1-2h；

C.洗涤：去除酶标板中的包被液，每孔加入100μL PBST缓冲液漂洗3次，每次5min；

D.封闭：去除酶标板中的PBST缓冲液，每孔加入100μL封闭液，37℃孵育1h，去除封闭液后用PBST缓冲液漂洗3次，每次5min；

E.抗体孵育：每孔加入100μL 1:1000稀释的所述兔抗多克隆抗体标准液，37℃孵育1h，漂洗3次；再每孔加入100μL 1:8000稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG标准液，37℃孵育1h，去除二抗，用PBST缓冲液漂洗3次，每次5min；

F.底物显色及终止反应：每孔加入100μL可溶性型TMB底物显色液，37℃避光显色10min，溶液显蓝色，每孔加入50μL 2M的H₂SO4终止反应，溶液变为黄色；

G.结果判定：用酶标仪测定OD₄₅₀，计算P/N值；如果P/N＞2.1则待测样为阳性；反之则为阴性。

4.权利要求1所述高粱花叶病毒间接ELISA检测试剂盒用于甘蔗中高粱花叶病毒的ELISA检测的用途。