[发明专利]一种重组菌株及其应用和制备9-氟甾体激素前体的方法

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，公开了一种重组菌株及其应用和制备9‑氟甾体激素前体的方法。本发明所述重组菌株在分枝杆菌或大肠杆菌中转化有包含kstD、kstD3、kstD_M中一种或两种以上基因的质粒；或在分枝杆菌或大肠杆菌基因组上整合有kstD、kstD3、kstD_M中一种或两种以上基因。本发明通过引入外源基因kstD、kstD3和kstD_M，构建重组分枝杆菌或大肠杆菌，并使用重组菌株细胞裂解液生产甾药前体，所获得的9β,11β‑环氧‑17α,21‑二羟基‑16β‑甲基孕‑1,4‑二烯‑3,20‑二酮具有极高转化率，同时阐明了生物转化的反应机理，为将来的工业化生产提供理论依据。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种重组菌株及其应用和制备9-氟甾体激素前体的方法。

背景技术

甾体激素药物作为抗生素之后的第二大类药物广泛用于治疗和预防许多疾病，例如消炎，利尿，避孕，促孕，抗雄激素和抗癌剂等。甾药的高需求促生了另一重要产业的蓬勃发展—甾药中间体(甾药前体)的提取与制备。微生物法制备甾药前体的工艺因其环境污染小，反应步骤少、产品损失低、收率高等突出优势，广泛应用于工业生产。近年来，通过微生物的生物转化对甾体化合物进行脱氢、氧化、羟化及侧链切割等反应而获得多种药物中间体。

例如，9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮(式Ⅳ)是生产9-氟甾体激素(如地塞米松，倍他米松，曲安西龙等)的关键前体，以9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(式Ⅰ)为底物合成Ⅳ是工业化生产Ⅳ的重要方法。但是关于9(11)-环氧甾体生物转化的研究还未见报道，反应机制也没有完全阐明。

目前，对于甾体化合物的生物转化大多都基于基因工程改造的微生物或分离纯化的酶催化。这些方法可以使甾体化合物的转化率有一定的提高，但甾体底物溶解度差、微生物发酵过程染菌以及分离纯化酶的高成本都是制约其工业应用的关键问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组菌株，使得所述重组分支杆菌能够显著提高9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮的转化率；

本发明的另一个目的在于提供所述重组菌株在生产9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮中的应用；

本发明的第三个目的在于提供基于所述重组菌株生产9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮中的方法。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种重组菌株，在分枝杆菌或大肠杆菌中转化有包含kstD、kstD3、kstD_M中一种或两种以上基因的质粒；或在分枝杆菌或大肠杆菌基因组上整合有kstD、kstD3、kstD_M中一种或两种以上基因。

针对现有甾体化合物的生物转化工艺中缺少以9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(式Ⅰ，以下简称Ⅰ)为底物合成9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮(式Ⅳ，以下简称Ⅳ)的方法，本发明通过在分枝杆菌或大肠杆菌中转化表达kstD、kstD3和kstD_M基因的质粒，以重组菌株的细胞裂解液进行生物转化，最终获得具有较高转化率的甾药前体Ⅳ。