[发明专利]一种重组菌株及其应用和制备9-氟甾体激素前体的方法

权利要求书

1.一种重组菌株，其特征在于，在分枝杆菌或大肠杆菌中转化有包含kstD、kstD3、kstD_M中一种或两种以上基因的质粒；或在分枝杆菌或大肠杆菌基因组上整合有kstD、kstD3、kstD_M中一种或两种以上基因；

kstD序列如SEQ ID NO:1所示，kstD3序列如SEQ ID NO:2所示，kstD_M序列如SEQ ID NO:3所示。

2.根据权利要求1所述重组菌株，其特征在于，所述kstD、kstD3、kstD_M均来源于新金分枝杆菌Mycobacterium neoaurum。

3.根据权利要求2所述重组菌株，其特征在于，所述kstD、kstD3均来源于新金分枝杆菌Mycobacterium neoaurum ATCC 25795。

4.根据权利要求2所述重组菌株，其特征在于，所述kstD_M来源于新金分枝杆菌Mycobacterium neoaurum NwIB-01。

5.根据权利要求1所述重组菌株，其特征在于，所述质粒为pMV261质粒。

6.根据权利要求1所述重组菌株，其特征在于，所述分枝杆菌为保藏编号为CGMCCNo.13532的分枝杆菌。

7.根据权利要求1所述重组菌株，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE)。

8.权利要求1-7任意一项所述重组菌株或/和其细胞裂解液在制备以9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯为底物合成9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮中的应用。

9.一种制备9-氟甾体激素前体的方法，其特征在于，包括：

步骤1、制备权利要求1-7任意一项所述重组菌株的细胞裂解液；

步骤2、向步骤1中的细胞裂解液加入底物9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯进行反应，获得β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮。

10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，步骤1包括：

步骤1.1、将权利要求1-7任意一项所述重组菌株进行扩繁，然后加入氢化可的松诱导培养，收集菌体用缓冲液洗涤并重悬；

步骤1.2、将重悬后的菌体细胞超声破碎，获得所述重组菌株的细胞裂解液。

11.根据权利要求10所述方法，其特征在于，步骤1.1为：

将权利要求1-7任意一项所述重组菌株接种于5mL液体培养基中30℃过夜培养，然后转移至50mL新鲜液体培养基中，在30℃、200r/min培养至OD₆₀₀为0.5-0.6，然后添加终浓度为0.1g/L的氢化可的松在30℃、200r/min诱导培养24h，收集菌体PBS缓冲液洗涤并重悬至OD₆₀₀为2.0。

12.根据权利要求10或11所述方法，其特征在于，所述缓冲液的pH值为6、6.5、7、7.5或8。

13.根据权利要求10所述方法，其特征在于，步骤1.2为：

将重悬后的菌体细胞在500W功率下超声破碎，以每破碎5s间歇5s的方式进行，共20min，全程冰上操作，获得所述重组菌株的细胞裂解液。