[发明专利]五种猪腹泻病毒多重PCR快速诊断试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了五种猪腹泻病毒多重PCR快速诊断试剂盒，包括5对PCR引物，还包括PCR反应液、PCR标准品、阳性对照品、阴性对照品。本发明还同时公开了上述试剂盒在同时特异检测五种猪腹泻病毒感染中的应用，这五种猪腹泻病毒为TGEV、GAR、GCR、PEDV和PCV2。

技术领域

本发明属于病毒核酸检测领域，具体涉及一种五种猪腹泻病毒多重PCR快速诊断试剂盒，可在同一个反应管内同时检测猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrheavirus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪轮状病毒A型(Porcine group A rotaviruses,GAR)、猪轮状病毒C型(Porcine group Crotaviruses,GCR)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)五种猪病毒，适用于临床及科研中对五种猪病毒的快速检测。

背景技术

近年来，随着养猪业向规模化和集约化方向发展，猪群发生多病原混合感染及继发感染的情况越来越普遍。感染猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒A型(GAR)、猪轮状病毒C型(GCR)、猪圆环病毒2型(PCV2)这几种疾病在临床上呈现出相似的腹泻症状，并且它们常常呈混合感染，而且上述疾病的发生使对其它疾病如呼吸和繁殖障碍的诊断变得复杂和困难，死亡率很高，给养猪业造成重大损失。

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起猪的一种以呕吐、腹泻和脱水为主要特征的肠道传染病。该病以7日龄以内仔猪发病为主，病程短、传播迅速、仔猪死亡率极高，可达100％。1978年，比利时和英国首次报道PEDV疫情，1984年，我国证实该病的存在。在2010-2012年中国不同地区均有PEDV大暴发的报道，造成哺乳仔猪大量死亡，严重影响了我国养猪业的健康发展。

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)属冠状病毒科、冠状病毒属，基因组为单股正链不分节段的RNA，全长28.5kb。对小肠造成损伤，产生消化和吸收不良，最终导致腹泻和脱水，引起哺乳仔猪死亡(Tuboly et al.,2000；南文金and娄高明,2010)。该病毒感染率高，造成的仔猪死亡率高(王黎等,2015)。

轮状病毒(RV)属于呼肠病毒科家族，无包膜，基因组是一条的11分段的双链RNA(Estes and Cohen,1989)。RV是引起包括人类以及其他动物腹泻的重要因素，目前轮状病毒以VP6基因分成8个种，其中A、B、C、E和H(GAR、GBR、GCR、GER和GHR)都已经在猪上检测出(Matthijnssens et al.,2012；Saif et al.,1980；Wakuda et al.,2011)。GAR在1975年首次报道，一直被认为是猪腹泻的一个主要病原(Amimo et al.,2013a；Ciarlet et al.,2002；Ciarlet et al.,1995；Miyazaki et al.,2011,2012)。GCR在1979年首次被检测出，很难进行细胞培养(Amimo et al.,2013b；Marthaler et al.,2013；Saif et al.,1988；Saif et al.,1996；Tsunemitsu et al.,1991)。GCR能引起严重胃肠感染且易造成散发性传播或大爆发(Bohl et al.,1982；Collins et al.,2008；Saif et al.,1980)。一般GAR被认为是引起猪腹泻的首因，而GBR、GCR的作用没那么大。Douglas marthaler等应用RT-PCR检测7508份猪腹泻样品的研究发现GAR的阳性率为62％，GCR感染率也很高(53％)，GCR主要感染1-20天仔猪，GAR主要感染21天以上仔猪。认为应该同时检测GAR、GCR(Marthaler etal.,2014)。