[发明专利]一种胰高血糖素多克隆抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学技术领域，具体涉及一种胰高血糖素多克隆抗体的制备方法。

背景技术

胰高血糖素(升糖素)是一种由胰脏胰岛α-细胞分泌的激素，是由29个氨基酸组成直链多肽，分子量为3485道尔顿。胰高血糖素是一种促进分解代谢的激素，它具有很强的促进糖原分解和糖异生作用，使血糖明显升高，1mol/L的激素可使3×10⁶mol/L的葡萄糖迅速从糖原分解出来。胰高血糖素还可激活脂肪酶，促进脂肪分解，同时又能加强脂肪酸氧化，使酮体生成增多。

胰高血糖素分泌过多会使血糖浓度增大，所以2型糖尿病的发生与发展中不仅是胰岛素功能和分泌异常所致，胰高血糖素也在发挥重要作用，而且也可能是糖尿病发病的一个独立因素。胰高血糖素异常升高是导致2型糖尿病患者血糖偏高的重要因素，检测胰高血糖素水平有助于临床准确判断糖尿病患者病情。目前已知检测胰高血糖素的方法主要是放射性免疫法(RIA)，也有报道采用胰高血糖素单抗依据免疫学原理进行检测的方法，如专利CN105116140A。

单克隆抗体虽然在特异性上要好于多克隆抗体，但是如果所识别的抗原表位被破坏，实验的结果将会受到很大的影响，这是单抗的缺点之一；而多抗可以识别多个抗原表位，即使是有少数几个抗原表位被破坏或者抗原构象改变，实验的结果也不会受到影响。在相同条件下，使用多抗可以提高检测的灵敏度，对于丰度偏低的蛋白也更容易检出。一般的多抗的制备方法是将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体，一般有兔多抗，鼠多抗等。然而这种一般的制备方法用来制备胰高血糖素多抗，其抗体量较少。目前，尚没有关于制备胰高血糖素多抗的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种胰高血糖素多克隆抗体的制备方法，使得所述制备方法能够提高多克隆抗体的抗体量，并且具备较高的效价。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种胰高血糖素多克隆抗体的制备方法，包括：

步骤1、利用碳二亚胺法将胰高血糖素与牛血清蛋白进行偶联，得到免疫抗原；

步骤2、将免疫抗原免疫兔子，取血离心，所得抗血清为胰高血糖素多克隆抗体。

针对现有工艺中缺少胰高血糖素多克隆抗体的制备方法的问题，本发明通过胰高血糖素与牛血清蛋白偶联形成免疫抗原，同时优化免疫抗原免疫、提取抗体等工艺步骤，获得效价较高、抗体量较多的胰高血糖素多克隆抗体。

作为优选，步骤1为：

称取胰高血糖素和N-羟基琥珀酰亚胺完全溶于DMF中，再加入DCC反应，反应液离心后收取上清液，将上清液滴加到溶有BSA的缓冲液中进行反应，然后将所得反应液透析，得到免疫抗原。

在本发明具体实施过程中，步骤1为：

取0.1mmol胰高血糖素，0.15mmol N-羟基琥珀酰亚胺完全溶于1ml的DMF中，再加入0.12mmol的DCC，置于4℃下反应搅拌12小时或搅拌过夜；反应后将反应液10000r/min离心10min，离心后收取上清液，将上清液缓慢滴加到溶有2mmol BSA的PBS(0.01mol/L、PH7.4)中，4℃下反应搅拌12小时或搅拌过夜；反应后将反应液放入透析袋中，在4℃条件下用PBS(0.01mol/L、PH7.4)透析三天，每天换三次透析液，得到免疫抗原。

作为优选，步骤2为：

用磷酸缓冲盐溶液将步骤(1)所得免疫抗原配制成免疫抗原溶液免疫兔子，第一次免疫时取1ml的免疫抗原溶液与等体积的弗氏完全佐剂，用乳化器进行乳化，使其完全混为一相，采用皮下多点注射的方式对每只兔子免疫注射2ml；

首次免疫两周后进行加强免疫，加强免疫时用等体积的弗氏不完全佐剂与1ml免疫抗原溶液混合用乳化器进行乳化使其完全混为一相，采用皮下多点注射的免疫方式对每只兔子注射2ml，之后每隔两周进行加强免疫一次；对兔子进行加强免疫4次后，于最后一次免疫一周后对兔子耳部静脉取血，将收集到的血液置于4℃冰箱过夜，第二天离心分离取上清液，得到胰高血糖素多克隆抗体。

采用常规的多克隆抗体制备方法与本发明所述方法进行对比，结果显示，本发明所述制备方法能够获得较多的胰高血糖素多克隆抗体，并具备较高的效价。同时，和其他蛋白偶联形成的免疫抗原相比，本发明胰高血糖素和牛血清蛋白偶联形成免疫抗原更适合制备高效价、高抗体量的多克隆抗体。