[发明专利]基于胶原海绵‑纳米纤维素的三维细胞支架的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物材料和组织工程学技术领域，具体涉及一种基于

胶原海绵-纳米纤维素的三维细胞支架的制备方法。

背景技术

胶原蛋白属于结构蛋白质，在体内以胶原纤维的形式存在。从新鲜的猪跟腱、牛跟腱等提取的胶原，能保持三股螺旋结构，在模拟生理条件下能再形成纤维，能明显激活细胞的生长，存在很好的生物活性及组织修复功能。但是由于存在力学强度差，易降解等特点大大限制了在医学及组织工程上的应用，因此提高胶原海绵的支架性能实现广泛应用尤其重要。

TEMPO氧化的纳米纤维素分散液（TOCN）具有比表面积大、长径比高、机械强度高等特点，较玻璃纤维、钢丝等材料具有更高的抗张强度。在复合材料制备中常常起到增强作用，同时在医药，组织工程等方面均具有很好的应用前景。

组织工程首先需要材料具有良好的生物相容性，需要细胞在材料内部长期生长而不影响组织功能的形成。纳米纤维素与胶原海绵制备成的混合材料具有较好的机械强度，能够避免胶原海绵遇液体易塌陷的缺点，同时便于细胞粘附及观察，在长期三维培养过程中细胞依然能够保持较好的生长状态和细胞密度。综上所述，胶原海绵-纳米纤维素混合支架为细胞三维生长提供了良好的支架材料，为组织工程进一步应用提供重要基础。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，现提供一种结果可靠、操作简便、可重复性强，能够长时间有效促进细胞的三维生长及增殖

的基于胶原海绵-纳米纤维素的三维细胞支架的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：基于胶原海绵-纳米纤维素的三维细胞支架的制备方法，其创新点在于：经过胶原海绵的制备、纳米纤维素的制备、胶原海绵-纳米纤维素的制备和培养步骤，完成基于胶原海绵-纳米纤维素的三维细胞支架的制备方法；具体步骤如下：

（1）胶原海绵的制备：除脂，分离牛蹄筋、猪蹄、鱼皮、软骨、肌腱或皮肤组织在胃蛋白酶的醋酸溶液中消化完全，最后透析冻干得到胶原海绵；

（2）纳米纤维素的制备：将纸浆粉碎后溶于蒸馏水中得到浆纸溶液，然后向浆纸溶液中加入一定量的TEMPO/NaBr充分混匀，然后加入NaClO氧化，反应结束后离心去除上层液体，并离心洗涤数次，将下层纳米纤维素溶于水溶液中超声分散得到纳米纤维素分散液；

（3）胶原海绵-纳米纤维素的制备：将纳米纤维素与胶原海绵进行混合，在800-1000r/min转速下充分搅拌混匀，然后将混合液放入容器中预冻4小时，然后取出放于冷冻干燥机中继续冻干48小时，得到胶原海绵-纳米纤维素；

（4）培养：将胶原海绵-纳米纤维素称重后放于48孔板，将293A、HUVEC、BMSC、U87和HepG2这5种细胞均匀生物打印于支架上，然后在10%FBS培养液中培养14天，取样检测，完成基于胶原海绵-纳米纤维素的三维细胞支架的制备。

进一步的，所述步骤（1）中的透析选用截留分子为3500的透析袋，所述冻干温度为4℃。

进一步的，所述步骤（2）中的浆纸选用去离子水进行清洗干净，从而去除浆纸表面上的残留杂质。

进一步的，所述步骤（2）中的TEMPO在溶液中的浓度为0.4毫摩尔/升，所述NaBr在溶液中的浓度为4毫摩尔/升、所述NaClO在溶液中的浓度为3.8毫摩尔/升。

进一步的，所述步骤（4）中的FBS培养液浸没胶原海绵，所述FBS培养液的更换时间为每两天更换一次。

进一步的，所述步骤（4）中的检测方法为：采用Livedead试剂盒检测胶原海绵材料对细胞相容性的影响，检测14天内细胞在胶原海绵上的生长增殖及功能形成情况。

本发明的有益效果如下：本发明提供的基于胶原海绵-纳米纤维素的三维细胞支架的制备方法，结果可靠、操作简便、可重复性强，能够长时间有效促进细胞的三维生长及增殖，同时对各类人体三维微组织的生成，尤其是对肝癌组织功能的形成有一定的作用，从而能够为肝组织工程的科学研究以及肝癌的临床治疗提供有益的参考。

附图说明

图1为本发明的胶原海绵-纳米纤维素细胞支架的形态图；

图2为本发明胶原海绵-纳米纤维素细胞支架对各类细胞的生物相容性的形态图；

图3为本发明HepG2细胞在支架上第2天、第8天及第14天时的显微形态。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。