[发明专利]基于胶原海绵‑纳米纤维素的三维细胞支架的制备方法

权利要求书

1.基于胶原海绵-纳米纤维素的三维细胞支架的制备方法，其特征在于：经过胶原海绵的制备、纳米纤维素的制备、胶原海绵-纳米纤维素的制备和培养步骤，完成基于胶原海绵-纳米纤维素的三维细胞支架的制备方法；具体步骤如下：

（1）胶原海绵的制备：除脂，分离牛蹄筋、猪蹄、鱼皮、软骨、肌腱或皮肤组织在胃蛋白酶的醋酸溶液中消化完全，最后透析冻干得到胶原海绵；

（2）纳米纤维素的制备：将纸浆粉碎后溶于蒸馏水中得到浆纸溶液，然后向浆纸溶液中加入一定量的TEMPO/NaBr充分混匀，然后加入NaClO氧化，反应结束后离心去除上层液体，并离心洗涤数次，将下层纳米纤维素溶于水溶液中超声分散得到纳米纤维素分散液；

（3）胶原海绵-纳米纤维素的制备：将纳米纤维素与胶原海绵进行混合，在800-1000r/min转速下充分搅拌混匀，然后将混合液放入容器中预冻4小时，然后取出放于冷冻干燥机中继续冻干48小时，得到胶原海绵-纳米纤维素；

（4）培养：将胶原海绵-纳米纤维素称重后放于48孔板，将293A、HUVEC、BMSC、U87和HepG2这5种细胞均匀生物打印于支架上，然后在10%FBS培养液中培养14天，取样检测，完成基于胶原海绵-纳米纤维素的三维细胞支架的制备。

2.根据权利要求1所述的一种基于胶原海绵-纳米纤维素的三维细胞支架的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中的透析选用截留分子为3500的透析袋，所述冻干温度为4℃。

3.根据权利要求1所述的一种基于胶原海绵-纳米纤维素的三维细胞支架的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的浆纸选用去离子水进行清洗干净，从而去除浆纸表面上的残留杂质。

4.根据权利要求1所述的一种基于胶原海绵-纳米纤维素的三维细胞支架的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的TEMPO在溶液中的浓度为0.4毫摩尔/升，所述NaBr在溶液中的浓度为4毫摩尔/升、所述NaClO在溶液中的浓度为3.8毫摩尔/升。

5.根据权利要求1所述的一种基于胶原海绵-纳米纤维素的三维细胞支架的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中的FBS培养液浸没胶原海绵，所述FBS培养液的更换时间为每两天更换一次。

6.根据权利要求1所述的一种基于胶原海绵-纳米纤维素的三维细胞支架的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中的检测方法为：采用Livedead试剂盒检测胶原海绵材料对细胞相容性的影响，检测14天内细胞在胶原海绵上的生长增殖及功能形成情况。