[发明专利]一种3D培养自体脂肪MSCs来源的神经前体细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体来说，涉及一种3D培养自体脂肪MSCs来源的神经前体细胞的方法。

背景技术

神经干细胞和神经祖细胞是神经元、神经胶质细胞等神经细胞的前体细胞，目前还没有准确区分二者的方法。神经前体细胞（neural precursor cells，NPCs）在神经系统发育和神经损伤修复过程中起重要作用，成体神经损伤修复困难与NPCs缺乏或沉默有关。既往的研究表明，移植同种异体NPCs能缓解帕金森、多发性硬化、脑胶质瘤等疾病，能促进神经退行性疾病、外伤等轴突损伤髓鞘新生和修复，缓解临床症状，但存在免疫排斥反应，嵌合率低，自体NPCs移植的医疗前景更令人期待。成体NPCs的分离依赖于组织学部位，一般成年人体内很难取材，而流产胎儿脑组织分离NPCs又受到伦理学限制，样本资源成为限制NPCs研究和应用的瓶颈。近些年来，对干细胞分化机制的研究取得了很大进展，发现胚胎干细胞和多种成体干细胞有神经前体细胞分化潜能，为神经前体细胞制备提供了新的思路。MSCs是样本资源最丰富的成体干细胞，是基于干细胞再生医学的最有前景的种子细胞。脂肪、脐带、骨髓等多种组织来源的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）能分化成netstin+神经前体细胞，具有神经元、神经胶质细胞等的分化潜能。骨髓样本采集对供者负担大、顾虑多，但临床抽脂技术非常成熟，相比于脐带等围产期组织和自体骨髓，自体脂肪MSCs衍生NPCs移植治疗神经损伤具有更多的样本来源优势。目前的研究发现，使用EGF、bFGF等细胞因子可以诱导MSCs向神经组织细胞分化。但如果要得到均一性高的nestin+NPCs则需要经过神经球培养阶段。神经球培养是将MSCs接种至疏水培养容器中培养，形成多细胞聚集的细胞球，属于半悬浮培养体系，其培养容量小、操作复杂、难于传代扩增，导致细胞收率低，限制了基于NPCs的神经组织修复医学的产业化转化。

针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。

发明内容

针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种3D培养自体脂肪MSCs来源的神经前体细胞的方法，能够批量培养高纯度的自体脂肪MSCs来源NPCs。

为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种3D培养自体脂肪MSCs来源的神经前体细胞的方法，包括如下步骤：

S1.制备胶原3D支架；

S2.采集脂肪组织，分离脂肪细胞，以MSCs培养基培养收获P0代MSCs，P0代MSCs以MSCs培养基重悬，培养收获P1代MSCs；

S3.预处理胶原3D支架；

S4.以MSCs培养基重悬P1代MSCs，接种至含胶原3D支架的组织培养皿中，使用NPCs培养基继续培养6天，收获NPCs。

进一步地，所述制备胶原3D支架的方法为：将胶原海绵修剪成片，将若干个胶原海绵片垛叠在一起为一个培养单位，以含重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白的DMEM/F12浸泡，孵育过夜，以生理盐水浸泡漂洗，淋干后置于无菌密封容器中，于4℃保存不超过30天，备用。

进一步地，所述步骤S2中分离脂肪细胞的方法为：剔除小血管和结缔组织，剪碎呈流体状；用生理盐水重悬离心后取脂肪层和沉淀层，以消化液消化，37℃水浴30分钟，每5分钟充分振荡；去悬浮絮状物，筛网过滤，滤液离心弃上清，以PBS重悬，静置，吸弃悬浮物后离心弃上清。

进一步地，所述步骤S2中培养收获P0代MSCs的方法为：以MSCs培养基重悬脂肪细胞，调整细胞密度为5×10⁵/mL，接种至组织培养瓶中，于CO₂培养箱内培养至70-80%汇合时收获；收获时吸弃培养上清，生理盐水洗涤培养表面，加入胰蛋白酶溶液，室温消化5分钟，加入抑肽酶溶液终止消化；400g离心5min，弃上清，收获沉淀物；生理盐水洗涤后，以细胞筛过滤，滤液400g离心5min，弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代MSCs。

进一步地，所述步骤S2中培养收获P1代MSCs的方法为：P0代MSCs以MSCs培养基重悬，调整细胞密度为6000个/cm²，接种至组织培养瓶，于CO₂培养箱内培养至70-80%汇合时收获P1代MSCs。